疲勞運動對大鼠腦缺血后額葉皮質(zhì)腦血流量的影響

楊寓迪， 劉 琳， 王偉佳， 王冬雪， 張健松 ， 趙 瑛

腦卒中是嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人健康的疾病，其致死率在所有疾病中居第三位[1]。腦卒中指由腦部血管破裂及阻塞引起血液循環(huán)障礙所導(dǎo)致的疾病，其中頸動脈狹窄或閉塞是20%～30%腦卒中患者的主要誘發(fā)因素[2]。其中缺血性卒中具有較高的致殘率[3]，腦卒中后腦血流量呈低灌注或血流減少等，會導(dǎo)致氧和能量供應(yīng)中斷，神經(jīng)細(xì)胞死亡并引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[4]。隨著腦缺血情況的不斷加劇，由此引發(fā)的血管性癡呆已成為腦卒中困擾社會和家庭的主要并發(fā)癥之一[5]。

近年來體育運動逐漸成為青年人和老年人追捧的生活方式之一。有大量的研究報道指出適宜的運動能夠延緩心腦血管疾病的發(fā)生[6]。研究顯示適當(dāng)?shù)倪\動可以提高高血壓、超重、高膽固醇血癥和糖尿病患者的生存率[7]，降低認(rèn)知障礙發(fā)生的風(fēng)險[8]，對心血管疾病的預(yù)防作用顯著[9]。但也有許多人一味追求運動的時間和運動的強度，一旦運動強度超過人體負(fù)荷則表現(xiàn)為過度運動或疲勞運動。有研究表明，過度運動或疲勞運動可能會導(dǎo)致海馬出現(xiàn)細(xì)胞核固縮、深染，線粒體損傷以及海馬中腦腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的下調(diào)，海馬功能受損，引起記憶能力下降等問題[10]。

本文采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎的方法建立大鼠腦缺血模型，并于腦缺血前進(jìn)行大鼠疲勞運動訓(xùn)練。采用雙通道激光多普勒腦血流儀對其腦血流量進(jìn)行測定，采用Morris水迷宮實驗對大鼠的學(xué)習(xí)記憶情況進(jìn)行測定，分別觀察疲勞運動對正常及腦缺血大鼠腦血流量和學(xué)習(xí)記憶功能的變化情況。為疲勞運動對腦卒中后的病程影響提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF級成年健康雄性Wistar大鼠120只，體重為180～240 g。由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，合格證編號：201700018990。實驗動物采用標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，實驗期間自由飲水、攝食。

適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，根據(jù)體重分層隨機分為4組：陰性對照組(SO，n=20)，疲勞運動組(OE，n=20)，雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎組(2-VO，n=40)，雙側(cè)頸總動脈并疲勞運動組(OE+2-VO，n=40)，訓(xùn)練2 w后對2-VO組及2-VO+OE組進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎，建立模型。

1.2 實驗方法

1.2.1 疲勞運動模型的建立 動物跑臺是依鼠跑步運動而設(shè)計的實驗裝置，運動強度可通過調(diào)整跑步的時間、跑步速度以及跑臺的坡度來控制，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后開始訓(xùn)練，采用遞增強度跑臺運動，坡度為15°，將大鼠放置在跑道后，初始速度為5 m/min，逐漸加速，直到增速至30 m/min，跑至力竭，以120 min為期限，1次/d，訓(xùn)練14 d，記錄大鼠完成訓(xùn)練的情況，建立疲勞運動模型[11]。SO組和2-VO組僅將大鼠置于跑臺上但不轉(zhuǎn)動跑臺。

1.2.2 腦缺血模型的建立 疲勞運動后對2-VO組及2-VO+OE組采用永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈(2-VO)的方法建立腦缺血大鼠模型。手術(shù)組大鼠術(shù)前12 h禁食、4 h禁水。用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸前部去毛消毒后沿頸正中切開，分離暴露左、右側(cè)頸總動脈，套以“0”號絲線雙重結(jié)扎，逐層縫合，SO組及OE組大鼠除不結(jié)扎頸總動脈，其余同手術(shù)組。術(shù)后每天肌肉注射青霉素[12]。

1.2.3 大鼠額葉皮質(zhì)腦血流量的測定 腦血流量實驗前的預(yù)處理：實驗前1 w，所有大鼠麻醉后俯臥，放置于腦立體定位儀上，固定頭部，采取平顱固定法進(jìn)行大鼠頭顱的立體定位。之后頭部剃毛，剪開頭部皮膚2 cm，用過氧化氫擦拭清除軟組織，暴露出顱骨。參照Paxions-Watson大鼠腦立體定位圖譜(第6版)[13]，確定額葉(FrA)位置(中心點為前囟前5 mm，矢狀縫右側(cè)旁開2 mm)，為后期正式實驗做準(zhǔn)備。

分別于疲勞運動訓(xùn)練或雙側(cè)頸動脈結(jié)扎14 d后，采用moorVMS雙通道激光多普勒腦血流儀進(jìn)行腦血流量的測定[14]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉20 min后，將多普勒光纖探頭固定至額葉處，記錄腦血流量、紅細(xì)胞聚集度、紅細(xì)胞運動速度、回光強度等，測試時間為10 min。腦血流量的單位采用的是血流灌注單位PU，紅細(xì)胞聚集度、紅細(xì)胞運動速度、回光強度的單位為AU。

1.2.4 學(xué)習(xí)記憶能力的測定 腦血流測定28 d后進(jìn)行Morris水迷宮測試[15]：實驗前分別在水池四個方向貼上不同標(biāo)記物，分別為三角形，正方形，圓形和五角星紙片。放入平臺，使平臺低于水面2 cm，控制水溫在(20.0±2.0)℃。實驗開始前移除平臺，將大鼠放入池內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，避免有刺激對大鼠造成應(yīng)激反應(yīng)。

定位航行實驗：每天相同時間點進(jìn)行實驗，將大鼠隨機從不同象限(除目標(biāo)象限)面壁置入池內(nèi)，記錄120 s內(nèi)尋找平臺的時間即逃避潛伏期，逃避潛伏期下降表示學(xué)習(xí)記憶增強。如果大鼠在120 s內(nèi)找到平臺，記錄120 s內(nèi)實際逃避潛伏期；如果在120 s 內(nèi)未找到平臺，由實驗者將其引上平臺并停留30 s，以熟悉環(huán)境，逃避潛伏期記錄為120 s。大鼠每天訓(xùn)練2次[16]，連續(xù)訓(xùn)練5 d，然后進(jìn)行定位航行測試。

空間探索實驗：將平臺移除，記錄大鼠穿越平臺次數(shù)。每次訓(xùn)練完成后將小鼠取出擦干，以防止低體溫造成的應(yīng)激。測試過程中保持實驗室內(nèi)燈光、物品等空間參照物擺放位置不變，排除干擾因素對實驗結(jié)果的影響。

可視平臺實驗：將水迷宮內(nèi)水排出部分，使水面低于平臺1～2 cm，在平臺處放置一個小旗，其余同定位航行實驗。

2 結(jié) 果

2.1 疲勞運動時期大鼠運動完成情況結(jié)果 大鼠疲勞運動完成百分率見圖1，在訓(xùn)練最初的7 d時間內(nèi)，絕大多數(shù)大鼠不能在120 min內(nèi)完成訓(xùn)練，表明這種強度對大鼠來說屬于疲勞運動。隨著訓(xùn)練周期的延長，部分大鼠均能順利完成，訓(xùn)練10 d以后除有個別大鼠因身體素質(zhì)原因不能完成外，其它大鼠能夠完成120 min的訓(xùn)練。

圖1 完成訓(xùn)練大鼠的百分率(%)

2.2 腦血流量及其相關(guān)參數(shù)的實驗結(jié)果 運動2 w后，與SO組相比，OE組腦血流量顯著升高(P<0.05)，2-VO組血流量顯著降低(P<0.01)，與2-VO組比較，OE+2-VO組腦血流量顯著降低(P<0.01)。結(jié)果提示，腦缺血后大鼠腦血流量顯著下降，但疲勞運動后的腦缺血大鼠腦血流量下降更為明顯，即使疲勞運動會使腦血流量有小幅度回升，這種情況也不能緩解。這種腦血流量的大幅度下降提示疲勞運動可能使得腦血流的損傷加劇。與2-VO組比較，OE+2-VO組紅細(xì)胞運動速度顯著降低(P<0.01)，結(jié)果提示疲勞運動合并腦缺血后腦血流量的顯著下降可能與紅細(xì)胞運動速度下降有關(guān)。與OE組比較，OE+2-VO組紅細(xì)胞聚集度顯著下降(P<0.05)?；毓鈴姸仁欠聪蛏⑸涔鈴姸鹊闹笜?biāo)，受屋內(nèi)光強度的影響，可以實時監(jiān)測探頭的狀況，與腦血流量成反比例，固保持回光強度一致，使腦血流量不受光強的影響，在本實驗中回光強度各組大鼠之間無顯著差異(P>0.05)，所測得的腦血流量值較為準(zhǔn)確(見表1)。

表1 血流量及相關(guān)參數(shù)測定結(jié)果

與SO組相比*P<0.05有顯著性差異**P<0.01有非常顯著性差異；與OE組相比▲P<0.05有顯著性差異▲▲P<0.01有非常顯著性差異；與2-VO組相比，●P<0.05有顯著性差異●●P<0.01有非常顯著性差異

2.3 Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶測試結(jié)果 模型建立后42 d后，對各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮測試(見表2)，與SO組相比，OE組逃避潛伏期和穿臺次數(shù)無顯著差異(P>0.05)，2-VO組和OE+2-VO逃避潛伏期顯著增加，穿臺次數(shù)顯著降低(P<0.05)，與2-VO組相比，OE+2-VO組逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)。說明運動對大鼠的學(xué)習(xí)記憶并無明顯的影響，但腦缺血42 d后動物的學(xué)習(xí)記憶能力會顯著下降，運動后腦缺血的動物學(xué)習(xí)記憶障礙更為明顯。平均速度結(jié)果顯示各組大鼠的平均速度無明顯變化(P>0.05)，排除了由于動物自身的因素對實驗結(jié)果造成的影響。

表2 各組大鼠Morris 水迷宮測試期結(jié)果

與SO組相比*P<0.05有顯著性差異**P<0.01有非常顯著性差異；與OE組相比▲P<0.05有顯著性差異▲▲P<0.01有非常顯著性差異；與2-VO組相比●P<0.05有顯著性差異●●P<0.01有非常顯著性差異

3 討 論

目前大多數(shù)文獻(xiàn)關(guān)于建立過度運動或疲勞運動的模型采取的方式主要有兩種：強迫游泳及跑臺訓(xùn)練[17]。在本實驗中，因后期要采用Morris水迷宮對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行測試，強迫游泳實驗可能會對其造成干擾，且腦血流前對大鼠的頭部要進(jìn)行預(yù)處理，為了防止傷口感染，故而本實驗采用動物跑臺建立疲勞運動模型。在訓(xùn)練最初的7 d時間內(nèi)，絕大多數(shù)大鼠不能在120 min內(nèi)完成訓(xùn)練，表明這種強度對大鼠來說屬于疲勞運動。但隨著大鼠適應(yīng)能力的不斷加強，10～14 d絕大多數(shù)大鼠均可完成訓(xùn)練，因此將疲勞運動訓(xùn)練時間定為14 d。這種做法既能減少大鼠的死亡率，又符合大鼠疲勞運動病理過程。SO組和2-VO組僅將大鼠置于跑臺上但不轉(zhuǎn)動跑臺，排除應(yīng)激反應(yīng)可能造成的影響。

腦血流的主要功能是運輸物質(zhì)和氧氣，以及帶走廢物和過多的熱量，腦血流量的變化是很多腦血管疾病的病理生理基礎(chǔ)之一[18]。研究結(jié)果顯示疲勞運動合并腦缺血后可造成腦血流量的顯著下降，且這種下降程度要大于單純結(jié)扎造成的腦血流的下降。提示疲勞運動合并腦缺血可能造成更為嚴(yán)重的腦損害，這種下降可能與紅細(xì)胞運動速度下降有關(guān)，與紅細(xì)胞聚集濃度無關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)腦部血流量供應(yīng)不足會導(dǎo)致白質(zhì)疏松，以白質(zhì)的退行性改變?yōu)橹饕攸c[19]，從而導(dǎo)致機體神經(jīng)功能損傷、學(xué)習(xí)記憶功能障礙等，且在腦缺血42 d為損傷關(guān)鍵點[15]。因此本實驗采用Morris水迷宮測定大鼠學(xué)習(xí)記憶功能，評價疲勞運動對大鼠腦缺血后行為功能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎42 d后大鼠會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙，與文獻(xiàn)報道相吻合[15]。額葉皮質(zhì)與注意力、短時記憶任務(wù)、推理感等高級心理活動有關(guān)，在非任務(wù)的長期記憶保持中也起著非常重要的作用。額葉皮質(zhì)缺血會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙[20]。這一點在本實驗中也得到驗證。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能與額葉皮質(zhì)腦血流量呈現(xiàn)一定的正相關(guān)。經(jīng)雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎后的大鼠會出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙，而在結(jié)扎之前進(jìn)行疲勞運動訓(xùn)練的大鼠腦血流量下降幅度更大，其出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙的程度也較單純的結(jié)扎頸總動脈要深，可能因為運動的強度過大導(dǎo)致了大鼠海馬細(xì)胞的凋亡增加，從而加重了學(xué)習(xí)記憶障礙的發(fā)生[9]。

適度運動能夠強身健體，改善自身的血液循環(huán)，但對于剛開始鍛煉的人來說，要結(jié)合自身的條件進(jìn)行運動，近來，運動過程中猝死的事件也屢見不鮮，“暴走”作為運動中的一項，也曾經(jīng)引起過熱議，對于不常運動的人來說，不少人在此之前并未參加過規(guī)律性的體育鍛煉，就進(jìn)行10～20千米以上的運動，除了對機體運動系統(tǒng)產(chǎn)生損傷外，還會加大神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡的風(fēng)險，若是患有認(rèn)知障礙疾病后，其發(fā)展成癡呆的速度也會較快，故應(yīng)該結(jié)合自身的條件，選擇適宜自己的運動，在運動期間也應(yīng)該循序漸進(jìn)，避免過度的疲勞運動對機體造成的損傷。