茂源鏈霉菌MTG基因pMA5載體的構(gòu)建及鑒定

陸姣姣 朱婧 穆冬冬 姜紹通 鄭志

摘要 [目的]提高M(jìn)TG產(chǎn)量并實(shí)現(xiàn)簡便有效的純化過程，以枯草芽孢桿菌為宿主構(gòu)建pMA5mtg重組質(zhì)粒。 [方法]通過提取茂源鏈霉菌的基因組DNA，擴(kuò)增mtg基因片段，再將異源信號肽與mtg基因片段進(jìn)行融合，融合片段和pMA5質(zhì)粒雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，菌落PCR和測序獲得陽性單克隆。然后將pMA5mtg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌感受態(tài)中，通過抗性篩選和雙酶切鑒定獲取重組菌株。 [結(jié)果]成功擴(kuò)增出mtg基因片段，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pMA5mtg。 [結(jié)論]獲得pMA5mtg重組表達(dá)菌株，為MTG的純化及其未來生物工程的改造提供了有效的方法。

關(guān)鍵詞 MTG;信號肽;載體;枯草芽孢桿菌

中圖分類號 S188;Q785文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）13-0092-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.030

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Construction and Identification of pMA5 Vector of Streptoverticillium mobaraensis MTG Gene

Abstract [Objective]In order to increase the MTG yield and achieve a simple and effective purification process，the recombinant vector pMA5mtg was constructed and expressed in Bacillus subtilis.[Method]The mtg gene fragment was amplified from the genomic DNA of Streptoverticillium mobaraensis，and the heterologous signal peptide was fused in front of the mtg gene fragment.The fusion fragment and the pMA5 vector were digested and ligated，and then transformed into E.coli competent cells.The positive strains were identified by PCR and extracted to check by DNA sequencing.The recombinant vector pMA5mtg was then transformed into the competent cells of B.subtilis，then the recombinant strain was obtained by resistance screening and double restriction enzyme digestion.[Result]The mtg gene fragment was successfully amplified，and the recombinant vector pMA5mtg was constructed.[Conclusion]The recombinant expression strain of pMA5mtg was obtained，which provided an effective method for the purification of MTG and its future bioengineering transformation.

Key words MTG;Signal peptide;Vector;Bacillus subtilis

微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（MTG）可催化蛋白質(zhì)間發(fā)生交聯(lián)，經(jīng)其交聯(lián)的產(chǎn)品穩(wěn)定性高，對蛋白酶降解和化學(xué)損害具有很高的抵抗力，因此，它們被廣泛應(yīng)用于食品、紡織、材料工程等各個領(lǐng)域[1-3]。但MTG生產(chǎn)成本較高，純化過程復(fù)雜，限制了MTG的應(yīng)用與發(fā)展[4-5]。

土壤微生物枯草芽孢桿菌是食品安全級菌株，具有高效的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，分泌蛋白能力強(qiáng)[6]。筆者運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建基因工程菌，擴(kuò)增mtg基因，與載體pMA5連接，轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，獲得MTG重組表達(dá)載體，以進(jìn)一步研究MTG在革蘭氏陽性菌中的表達(dá)及純化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料。茂源鏈霉菌（Streptoverticillium mobaraensis）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）均購自中國微生物菌種保藏中心，再由合肥工業(yè)大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)保存。載體構(gòu)建所用質(zhì)粒pMA5，大腸桿菌DH5α。

1.1.2 主要試劑。

EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit（TransGen），EasyPure Plasmid MiniPrep Kit（TransGen），EasyPure PCR Purification Kit（TransGen），EasyPure Quick Gel Extraction Kit（TransGen），T4-DNA Ligase（TransGen），Enzyme NdeI、NheI（TransGen），Taq DNA Polymerase（Sangon Biotech），F(xiàn)astPfu DNA Polymerase（TransGen），DNA Marker，Tryptone，Yeast extract，NaCl，Agar，Ampicillin，Kanamycin等。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌DH5α感受態(tài)的制備。

取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，轉(zhuǎn)接入100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.5～0.8，將培養(yǎng)液在冰上放置30 min，5 000 r/min、10 min、4 ℃離心收集菌體;用100 mL冷水重懸菌體，6 000 r/min、20 min、4 ℃離心去上清，如此漂洗3次;2 mL 10%甘油重懸菌體，7 000 r/min、10 min、4 ℃離心去上清;最后用0.5 mL 10 %甘油重懸菌體，然后將其分裝在1.5 mL EP管中，每管50 μL，-80? ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 枯草芽孢桿菌感受態(tài)的制備。接種枯草芽孢桿菌于3 mL LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。取2.6 mL過夜培養(yǎng)物接入40 mL（LB+0.5 mol/L山梨醇）中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.85～0.95，將菌液冰水浴10 min，然后5 000 r/min、5 min、4 ℃離心收集菌體。用50 mL預(yù)冷的電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基（0.5 mol/L山梨醇，0.5 mol/L甘露醇，10 %葡萄糖）重新吹懸菌體，5 000 r/min、5 min、4 ℃離心去上清，如此漂洗4次。將洗滌后的菌體吹懸于1 mL電轉(zhuǎn)培養(yǎng)基中，分裝在1.5 mL EP管中，每管50 μL ，-80? ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 質(zhì)粒和基因組DNA的提取。

使用質(zhì)粒DNA提取試劑盒和細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（TransGen）分別進(jìn)行質(zhì)粒和基因組DNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 mtg重組表達(dá)載體pMA5mtg的構(gòu)建。

利用Clonemanager軟件設(shè)計(jì)引物，所用引物均在表1中列出。以B.subtilis 168基因組DNA為模板，用引物p1和p2擴(kuò)增SPwapA信號肽基因片段，將NdeI位點(diǎn)添加到引物p1的5末端。以S.mobaraensis基因組DNA為模板，通過引物p3和p4擴(kuò)增 mtg片段，將NheI位點(diǎn)添加到引物p4的5末端。引物p2和p3的5末端反向互補(bǔ)配對。再以SPwapA和mtg擴(kuò)增子的混合物作為模板，用引物p1和p4通過融合PCR擴(kuò)增片段SPwapA-mtg。將質(zhì)粒pMA5與融合片段SPwapA-mtg分別進(jìn)行NdeI和NheI雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物切膠回收，連接轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中，菌落PCR篩選陽性克隆，再將重組質(zhì)粒提取進(jìn)行測序。將測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中。

1.2.5 大腸桿菌的電轉(zhuǎn)化。

取出-80 ℃冰箱存儲的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上解凍。解凍后，吸取2 μL質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，吸取至已預(yù)冷的0.2 cm電擊杯中，200 Ω、2.5 kV進(jìn)行電擊，電擊后迅速加入1 mL無菌未加抗性的LB液體培養(yǎng)基，放在37 ℃搖床中低速振蕩培養(yǎng)1.5 h。待菌液混濁后，涂布于LB+氨芐霉素的平板上。平板倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

從平板上挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定正確的陽性克隆接種于LB+氨芐霉素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒送去公司測序。

1.2.6 枯草芽孢桿菌的電轉(zhuǎn)化。

取出存儲于冰箱中的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，解凍。取2 μL質(zhì)粒加入到感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，吸取至已預(yù)冷的0.2 cm電擊杯中，200 Ω、2.5 kV進(jìn)行電擊，電擊后迅速加入1 mL無菌未加抗性的RM培養(yǎng)基（LB+0.5 mol/L山梨醇+0.38 mol/L甘露醇），37 ℃搖床培養(yǎng)1.5 h至混濁。涂布于LB+卡那霉素的平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。

從平板上挑取單菌落，接種于LB+卡那霉素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行NdeI和NheI雙酶切驗(yàn)證，所切條帶與理論大小一致時，再將質(zhì)粒送去測序，最終獲得陽性重組菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPwapA信號肽的擴(kuò)增

為了保證mtg基因在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行分泌表達(dá)，需要信號肽指導(dǎo)其分泌。以B.subtilis 168基因組DNA為模板，擴(kuò)增SPwapA信號肽基因片段。電泳結(jié)果如圖1所示，SPwapA長度130 bp，與PCR所得片段大小一致。

2.2 S.mobaraensis mtg的擴(kuò)增

以S.mobaraensis基因組DNA為模板，擴(kuò)增mtg基因片段。電泳結(jié)果如圖2所示，mtg長度1 200 bp，與PCR所得片段大小一致。

2.3 SPwapA與mtg的融合

以SPwapA和mtg擴(kuò)增子混合物作為模板，用引物p1和p4通過融合PCR擴(kuò)增片段SPwapA-mtg。SPwapA片段長度為130 bp，mtg片段長度為1 200 bp，故融合片段SPwapA-mtg長度應(yīng)為1 330 bp。電泳結(jié)果見圖3，融合片段1 330 bp比片段mtg略長，與PCR所得片段大小一致。

2.4 連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化后陽性克隆鑒定

質(zhì)粒pMA5與融合片段SPwapA-mtg分別進(jìn)行NdeI和NheI雙酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物切膠回收，再用T4連接酶連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α中，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，使用引物p1和p4，擴(kuò)增目的片段SPwapA-mtg，SPwapA長度130 bp，mtg長度1 200 bp。電泳結(jié)果如圖4所示，目的片段總長度1 330 bp，與PCR所得片段大小一致，說明片段SPwapA-mtg成功插入到載體pMA5上。將PCR鑒定正確的陽性克隆接種于LB+氨芐霉素的液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒送去公司測序。

2.5 雙酶切驗(yàn)證

將測序正確的pMA5mtg重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，在抗性平板上涂布并培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種于LB+卡那霉素的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行NdeI和NheI雙酶切驗(yàn)證。電泳結(jié)果如圖5所示，重組質(zhì)粒pMA5mtg經(jīng)雙酶切作用后有2條清晰的條帶，較小的片段大小為1 300 bp左右，較大的片段為7 100 bp左右，與SPwapA-mtg大?。? 330 bp）和pMA5片段大?。? 107 bp）相符，且其DNA片段測序結(jié)果顯示所插入的序列完全正確。

3 討論

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是催化蛋白質(zhì)或多肽間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，可促進(jìn)蛋白質(zhì)凝膠化，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用[7-8]。微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是目前研究的熱點(diǎn)，但存在成本高、活力低、穩(wěn)定性差等問題[9]。利用分子生物學(xué)技術(shù)對MTG基因進(jìn)行改造并實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)是目前最為有效的方法[10-11]。

該試驗(yàn)通過基因工程技術(shù)在大腸桿菌中構(gòu)建pMA5mtg重組載體，再將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌中，從而獲得重組表達(dá)菌株。這為MTG在革蘭氏陽性菌中的表達(dá)研究提供了依據(jù)，同時也證明了枯草芽孢桿菌作為異源蛋白工業(yè)生產(chǎn)的宿主具有很大的潛力，是一個有意義的研究性課題。

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