酶解法制備豆粕水解肽工藝優(yōu)化

許 騰 盧 聰 范海茹 王東暉 李淑英 范 蓓 王 艷 王鳳忠

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所,北京 100193)

豆粕是大豆油脂最主要的加工副產(chǎn)品,其蛋白質(zhì)含量為45%～55%,且80%以上為水溶性蛋白質(zhì)[1]。但通常被用作飼料,少部分用于發(fā)酵食品的加工[2],造成了蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。 研究表明,豆粕中的蛋白質(zhì)酶解制備的低肽混合物,即大豆功能性水解肽,具有良好的生物活性[3-4],尤其是分子量小于1 000 Da 的水解肽,具備降血壓[5-6]、降膽固醇[7]、抗氧化[8-9]、促進(jìn)胃腸道吸收[10]、調(diào)節(jié)血糖濃度[11]等功效。因此,將豆粕用于生產(chǎn)小分子功能性水解肽,既降低了資源浪費(fèi),也極大提高了豆粕的附加值。

大豆水解肽的制備方法主要有酸水解法[12]、酶水解法[13-15]和生物發(fā)酵法[16-17]。 我國大豆肽的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用酶水解法。 與其他方法相比,酶水解作用條件溫和,易于控制水解程度,能很好地保存氨基酸的營養(yǎng)價(jià)值。 但酶解法也存在一定的問題,如在蛋白質(zhì)酶解過程中,由于肽鏈斷開,肽鏈中的疏水性氨基酸暴露,使水解產(chǎn)物多產(chǎn)生苦味[18]。

目前,豆粕酶解制備小分子肽的研究主要集中在豆粕的復(fù)合酶解與生物活性肽制備等方面[19]。 國內(nèi)的研究者主要通過對堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶等復(fù)合酶開展豆粕制備低苦味多肽的酶解工藝研究[20-24],而有關(guān)結(jié)合智能感官評價(jià)技術(shù)評價(jià)多個(gè)酶組合分步酶解豆粕制備水解肽的研究尚鮮見報(bào)道。 在前人研究的基礎(chǔ)上,本研究針對豆粕酶解蛋白酶的選擇、酶解工藝參數(shù)、水解液的脫苦等方面進(jìn)行探討及優(yōu)化,以期獲取制備苦味低且生物活性高的豆粕水解肽的最佳酶解方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫豆粕購自中糧集團(tuán)；堿性絲氨酸蛋白酶(200 U·mg-1)購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶(100 U·mg-1)購自沃凱國藥集團(tuán)；中性蛋白酶(100 U·mg-1)、菠蘿蛋白酶(600 U·mg-1)購自上海源葉生物有限公司；復(fù)合蛋白酶(120 U·mg-1)、脫苦蛋白酶(200 U·mg-1)購自北京伊諾凱科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

AL 204 型精密電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HH-1 型數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇榮華有限公司；testo 206-1 型手持pH 計(jì),德國德圖儀器有限公司；LYNX 6000 型高速冷凍離心機(jī),美國Thermo Scientific 公司；UDK159 型全自動(dòng)凱氏定氮儀,意大利VELP 公司；Metrohm 916 Ti-Touch 型全自動(dòng)電位滴定儀,瑞士萬通中國有限公司；L-8900 型全自動(dòng)氨基酸分析儀,日本日立公司；ASTREE 型電子舌,法國阿爾法莫斯公司；LC98Ⅱ型高效液相色譜儀[SB-404-SE 7μ/4.6×250 mm/排阻限1 000 000(葡聚糖)],北京溫分分析儀器技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 氨基酸含量的測定 參考文獻(xiàn)[25-26]的方法。 取1 g 豆粕樣品于消化管中,加入10 mL 6 mol·L-1HCl,然后置于110℃烘箱中水解22 h,再經(jīng)過濾、氮吹、稀釋,取適量上機(jī)檢測。

1.3.2 總蛋白含量的測定 參考徐新娟等[27]的方法。 取1 g 豆粕樣品進(jìn)行消化,使用全自動(dòng)凱氏定氮儀測定總蛋白含量。

1.3.3 酶解試驗(yàn) 稱取7 g 粉碎后的豆粕粉于錐形瓶中,加適量去離子水,然后置于90℃水浴鍋預(yù)處理10 min 后冷卻。 將水浴鍋調(diào)節(jié)至蛋白酶1(表1)最適溫度,向錐形瓶中加入2 mol·L-1HCL 或2 mol·L-1NaOH調(diào)節(jié)pH 值至蛋白酶1 最適pH 值,加入0.28 g 蛋白酶1,置于水浴鍋水解一定時(shí)間。 蛋白酶1 酶解完成后,將水浴鍋調(diào)節(jié)至蛋白蛋白酶2(表1)最適溫度,pH 值調(diào)節(jié)至蛋白酶2 最適pH 值,然后加入0.28 g 蛋白酶1 水解一定時(shí)間。 同理完成蛋白酶3(組合7)的水解。 水解試驗(yàn)全部完成后,調(diào)節(jié)pH 值使未水解的蛋白沉淀,沸水浴條件下高溫滅活,然后迅速冷卻至室溫,高速離心(10 000 r·min-1,20 min)后,取上清液定容至100 mL 供分析用,部分凍干供后期分析。

表1 復(fù)合酶的組合Table1 Combination of complex enzymes

1.3.4 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率的測定 取適量蛋白水解液,加入10 mL 10%三氯乙酸(trichloroacetic acid solution,TCA),混勻后放置30 min,然后4 000 r·min-1離心10 min,保留上清液,采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量,按照公式計(jì)算蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率：

式中,X為蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率；P 為酶解液中溶于10%三氯乙酸的氮含量；P0為未酶解前溶于10%三氯乙酸的氮含量；S0為底物蛋白質(zhì)的總氮含量。

1.3.5 水解度的測定 參考肖凱軍等[34]的方法。 豆粕完全水解液：稱取一定量豆粕于燒杯中,加6 mol·L-1鹽酸密封后于烘箱中110～120℃水解24 h,經(jīng)布氏漏斗過濾后吸取5 mL 上清液,采用凱氏定氮法測定豆粕中蛋白質(zhì)含量。 吸取適量豆粕完全水解液,使得其蛋白含量為0.4 g,調(diào)節(jié)pH 值至7.5～8.0,然后用全自動(dòng)電位滴定儀測定豆粕完全水解液的耗堿量。

樣品水解液：稱取適量的各組酶解后的樣品溶液,經(jīng)凱氏定氮法測定樣品蛋白質(zhì)含量后,吸取適量酶解液使其蛋白含量為0.4 g,調(diào)節(jié)pH 值至7.5 ～8.0,然后用全自動(dòng)電位滴定儀測定樣品水解液的耗堿量。 同理測得原料豆粕的耗堿量。 按照公式計(jì)算水解度：

式中,A 為樣品水解液耗堿量；B 為原料豆粕的耗堿量；C 為完全水解液的耗堿量。 這里需保證所取原料、樣品水解液及完全水解液中的蛋白含量一致。

1.3.6 口感測定 分別取水解肽溶液的凍干粉末0.1 g,加入100 mL 超純水,溶解后上機(jī)檢測。

1.3.7 水解肽分子量分布 參考魯紅[35]的方法。 分別取20 mg 1.3.3 中制備的水解肽溶液的凍干粉末,流動(dòng)相為水溶液,色譜柱為SHODEX SB-801HQ 凝膠柱,應(yīng)用凝膠滲透色譜儀測定水解肽的分子量分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕中氨基酸組分分析

經(jīng)檢測分析,豆粕總蛋白含量為50.96%。 由圖1可知,豆粕中共檢出15 種氨基酸,含量總和為51.09%。 其中,包含7 種必需氨基酸：賴氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、異亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)及蛋氨酸(Met),而蛋氨酸(Met)是豆粕的限制性氨基酸。 根據(jù)FAO/WHO 推薦豆粕中標(biāo)準(zhǔn)氨基酸含量[36],經(jīng)計(jì)算其氨基酸評分為

圖1 豆粕中氨基酸組分及含量Fig.1 Composition and content of amino acid from soybean meal

56.77%(理想蛋白質(zhì)的必需氨基酸AAS 值應(yīng)達(dá)總量的40%),表明豆粕的氨基酸組成具有必需氨基酸比例平衡、含量豐富的特點(diǎn),具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。

2.2 酶解試驗(yàn)結(jié)果

在豆粕蛋白酶解前進(jìn)行加熱處理,使豆粕蛋白緊密的內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散,暴露酶的作用位點(diǎn),有利于蛋白酶的結(jié)合。 轉(zhuǎn)化率越高表示試驗(yàn)的可行性越高,水解度可以反映水解液中大豆蛋白肽鏈的肽鍵被酶切割的程度。 由表2可知,第7 組堿性+中性+脫苦蛋白酶組合獲取的豆粕水解肽蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率和水解度均最高,分別達(dá)到69.19%、16.36%,表明選用該酶解組合水解蛋白更徹底。

表2 豆粕酶解轉(zhuǎn)化率、水解度結(jié)果Table2 Results of enzymolysis conversion rate and hydrolysis degree of hydrolyzed peptides from soybean meal

2.3 豆粕水解肽差異顯著性分析

圖2 豆粕水解肽顯著性差異分析Fig.2 Analysis on the significant difference of hydrolyzed peptides from soybean meal

將各組得到的水解肽進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA)。 由圖2可知,橫向維度第一主成分(PC1)分析顯示,豆粕完全水解肽與各試驗(yàn)組酶解得到的豆粕水解肽差異性顯著；縱向維度第二主成分(PC2)分析顯示,各試驗(yàn)組中豆粕堿性蛋白酶水解肽、堿性+中性+脫苦蛋白酶水解肽與其他試驗(yàn)組水解肽分離明顯,說明單酶、兩種酶組合及三種酶組合產(chǎn)生的水解肽差異性顯著。

2.4 豆粕水解肽鮮咸結(jié)果分析

由圖3可知,與其他酶組合相比,堿性+中性+脫苦蛋白酶組水解肽的鮮味與咸味兩者比例之和在12以上,鮮、咸味較強(qiáng),可掩蓋一定苦味,綜合風(fēng)味較佳。

圖3 豆粕水解肽鮮咸分析Fig.3 Analysis of umami and salty taste of hydrolyzed peptides from soybean meal

2.5 豆粕水解肽分子量分析

由圖4可知,7 種酶組合水解液分子量分布在1 000 Da以下分別為堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶解水解肽(83.2%)、堿性蛋白酶+菠蘿蛋白酶解水解肽(90.1%)、 堿性蛋白酶+ 脫苦蛋白酶解水解肽(90.0%)、 堿性蛋白酶+ 復(fù)合蛋白酶解水解肽(91.3%)、堿性蛋白酶水解肽(88.7%)、堿性蛋白酶+中性蛋白酶解水解肽(89.5%)、堿性蛋白酶+脫苦蛋白酶+中性蛋白酶解(89.8%),且水解肽占比均在80%以上,表明7 種組合酶解條件對豆粕的酶解均較徹底。

3 討論

圖4 豆粕水解肽中主要的分子量分布段及其所占百分比Fig.4 Main molecular weight distribution segments and their percentages in each group of hydrolyzed peptides

酶解豆粕可以產(chǎn)生具有特殊生物活性的小分子肽,且在一定程度上可消除豆粕的不良風(fēng)味及抗?fàn)I養(yǎng)因子[37],從而提高豆粕的營養(yǎng)價(jià)值和利用價(jià)值。 轉(zhuǎn)化率、水解度通常作為評價(jià)蛋白質(zhì)酶解程度的指標(biāo),以此確定最佳酶解工藝條件,可得到小分子肽得率較高的水解產(chǎn)品。 張亞麗等[38]通過胰蛋白酶對變性豆粕進(jìn)行水解,正交試驗(yàn)法優(yōu)化獲得最佳酶解條件下,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率為69.34%；黃雅燕等[39]以轉(zhuǎn)化率和水解度為指標(biāo),利用正交試驗(yàn)優(yōu)化堿性蛋白酶酶解工藝,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率達(dá)75.73%,水解度為49.30%,大豆多肽相對分子質(zhì)量分布主要集中在5 000 Da 以下,占比達(dá)80.21%。 近年來越來越多的研究者開始利用復(fù)合酶法水解蛋白質(zhì),以獲得蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率、水解度更高的酶解工藝和酶組合。 其中,張曉峰等[24]選擇堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對豆粕進(jìn)行優(yōu)化酶解,將轉(zhuǎn)化率提高至72.3%；李景等[40]將堿性蛋白酶分別與中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行組合,發(fā)現(xiàn)用堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合進(jìn)行水解豆粕時(shí),水解度最高,可達(dá)到46.83%,并測得水解產(chǎn)物的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制率可達(dá)到72.21%。 但豆粕水解肽通常有較強(qiáng)的苦味[41],影響其在食品中的應(yīng)用,只考慮轉(zhuǎn)化率和水解度已不能滿足產(chǎn)業(yè)需求。 通過感官評價(jià)來優(yōu)化酶解工藝,制備口感好的生物活性肽,已成為研究者們新的探索方向[42]。 王慧云等[20]結(jié)合感官評價(jià)開展了中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶復(fù)配酶解豆粕的工藝研究,獲得了鮮味濃郁的呈味肽；林洋等[21]以豆粕為發(fā)酵原料,利用堿性、中性蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行復(fù)配酶解豆粕,并利用鹽酸奎寧的苦味對比確定水解液的苦味值,獲得了低苦味的小肽混合物,其分子量≤1 000 Da 的水解肽可達(dá)74.67%。 本試驗(yàn)中,堿性+中性+脫苦蛋白酶組合獲得的豆粕水解肽蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率和水解度分別達(dá)到69.19%、16.36%,獲得的低苦味小肽混合物分子量≤1 000 Da 的水解肽高達(dá)89.8%。

研究表明,酶切位點(diǎn)在疏水氨基酸和芳香族氨基酸羧基端的蛋白酶,特別是酶切位點(diǎn)為Tyr、Pro、Trp、Phe 和Leu 羧基端的蛋白酶是制備較高生物活性肽的理想水解酶[43]。 在此基礎(chǔ)上,本試驗(yàn)選用同時(shí)含有內(nèi)切酶和外切酶的復(fù)合酶對豆粕進(jìn)行酶解,對酶解后的水解肽進(jìn)行分子量分布測定,并首次結(jié)合智能感官評價(jià)系統(tǒng),結(jié)果顯示,7 個(gè)酶組合豆粕水解肽中分子量在1 000 Da 以下的占比均在80%以上,其中堿性+中性+脫苦蛋白酶組合的分子量≤1 000 Da 的水解肽可達(dá)89.8%,且該組合所得水解肽的口感與其他組合具有顯著差異,鮮、咸味明顯,苦味能夠被有效遮蓋。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過比較單酶、雙酶及三酶等酶組合對豆粕的酶解效果,優(yōu)化豆粕水解肽的制備工藝條件,結(jié)果表明,堿性蛋白酶+脫苦蛋白酶+中性蛋白酶復(fù)合酶制備的水解肽的理化性質(zhì)及口感更優(yōu)。 本研究首次結(jié)合智能感官評價(jià)技術(shù)及多變量統(tǒng)計(jì)方法直觀對比復(fù)合酶解方案的綜合效果,獲得了制備苦味低且生物活性高的豆粕水解肽的方法,且工藝簡單,符合實(shí)際生產(chǎn)要求,為豆粕資源的開發(fā)和低苦味肽的研究提供了數(shù)據(jù)支持與參考。