高效液相色譜法測定不同類別食品中的葉黃素

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(1.中國廣州分析測試中心， 廣東廣州510070；2.廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室， 廣東廣州510070)

葉黃素屬于類胡蘿卜素，是一種天然、營養(yǎng)和多功能的食品添加劑，素有“植物黃金”之稱[1-3]。人體自身不能合成葉黃素，只能從食物中攝取[4]。我國衛(wèi)生部已批準(zhǔn)，葉黃素可添加到嬰幼兒配方食品中，因此葉黃素一直都是功能食品領(lǐng)域研究的熱點。

食品中添加的葉黃素有三種形態(tài)：葉黃素單體、葉黃素微囊粉或葉黃素酯。葉黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有多個共軛雙鍵，容易被氧化失去原有的生物活性，因此葉黃素單體的應(yīng)用范圍受到限制[5-6]。葉黃素微囊粉是通過微膠囊化技術(shù)對葉黃素單體進行包埋的微囊產(chǎn)品，可最大限度保持葉黃素的生物活性，同時還可以實現(xiàn)緩釋吸收[6-7]。微囊中葉黃素的檢測，需要先破微囊壁，再提取葉黃素。葉黃素酯是葉黃素與脂肪酸(如棕桐酸、月桂酸等)作用生成的酯類衍生物，屬于新資源食品。葉黃素酯種類很多，但經(jīng)過堿性皂化(水解)均可生成葉黃素單體[8]。葉黃素微囊粉和葉黃素酯穩(wěn)定性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于葉黃素單體，更便于貯藏和應(yīng)用。

葉黃素形態(tài)不同，決定了樣品前處理方法不同。目前，在現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法和相關(guān)文獻中，主要是根據(jù)樣品基質(zhì)選擇樣品前處理方法[9-13]。本文對不同類別食品中不同形態(tài)的葉黃素分別進行了研究，建立了有針對性的樣品前處理方法。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀—二極管陣列檢測器( LC-20A 2300，日本島津公司)；KQ-2200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；高速冷凍離心機(Hitachi)；電熱恒溫水浴鍋(上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司)；BT125D電子天平(Sartorius)；KL512型氮吹儀(北京康林科技有限責(zé)任公司)。

甲醇(色譜純 Merck )；乙腈、乙醚、丙酮、石油醚、無水乙醇、抗壞血酸(分析純 廣州化學(xué)試劑廠)；2,6-二叔丁基對甲酚(BHT 阿拉丁)；蒸餾水。

乙醇提取劑：稱取 0.75 g BHT于 500 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容。甲醇、丙酮和乙腈提取劑均含 0.15 % BHT。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

葉黃素(95.8 %，ChromaDex)：精密稱取0.010 44 g(精確至0.01 mg)于100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，得到濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別移取 0.125、0.250、0.500、2.00、5.00、10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于6個 100 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容,得到濃度為0.125、0.250、0.500、2.00、5.00、10.0 mg/L 的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 樣品前處理

含有葉黃素單體、葉黃素微囊粉或葉黃素酯的樣品，前處理方法分別選用超聲波輔助提取法、酶解—超聲波提取法或堿皂化—液液萃取法。

1.3.1 葉黃素單體

非含油樣品：稱取0.05～5.0 g試樣于 50 mL聚丙烯刻度離心管中，加入 40 mL乙醇提取劑，于冰水浴中超聲提取 30 min，定容，過濾上機。

含油樣品：前處理過程提取劑改為丙酮提取劑，其他步驟同“非含油樣品”。

1.3.2 葉黃素微囊粉

微囊壁材種類很多，常見的葉黃素微囊壁材為水溶性壁材和蛋白質(zhì)壁材[14-16]。

水溶性壁材：稱取0.05～2.0 g試樣于100 mL容量瓶中，加入水15 mL和0.1 g抗壞血酸，渦旋振蕩溶解后于60 ℃ 水浴5 min，不斷震蕩使微囊壁材充分溶解后，加入無水乙醇80 mL，冰水浴超聲提取30 min，用無水乙醇定容，過濾上機。

蛋白質(zhì)壁材：稱取0.05～2.0 g試樣于100 mL容量瓶中，加入15 mL 水、0.1 g抗壞血酸和0.15 g胰蛋白酶，以下步驟同“水溶性壁材”。

1.3.3 葉黃素酯

葉黃素酯的堿皂化—液液萃取法已經(jīng)成熟，前處理方法參考相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法[9,17]。

皂化：稱取0.05～2.0 g試樣于250 mL皂化瓶中，加入水10 mL、0.5 g抗壞血酸和無水乙醇40 mL超聲混勻，再加入 50 %氫氧化鉀溶液10 mL，搖勻，于75 ℃ 水浴皂化30 min，皂化后快速冷卻；

萃?。簩⑸鲜鋈芤阂迫?50 mL分液漏斗中，用石油醚/乙醚(1/1,V/V)50 mL分3次洗滌皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，振搖萃取5 min后靜置分層。移取水層，重復(fù)萃取1次，合并醚層；

洗滌：每次用50 mL蒸餾水洗滌醚層，直至洗至中性；

濃縮定容：將醚層用氮氣吹干，依據(jù)葉黃素的線性范圍，用乙醇提取劑定容至合適的體積，過濾上機。

1.3.4 高脂肪、高蛋白食品

對于脂肪和蛋白含量高的食品，如：奶粉、蛋白粉和乳基粉，添加的原料主要是葉黃素單體或者葉黃素微囊粉。但由于樣品基質(zhì)的干擾和葉黃素含量較低，前處理過程需要選用堿皂化—液液萃取法，既可以減少基質(zhì)干擾，還可以濃縮提取液，使其濃度落在葉黃素線性范圍內(nèi)。因此，前處理過程參照“1.3.3節(jié)”。

1.4 色譜條件：

色譜柱：迪馬C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL；檢測波長：446 nm。流速：1.0 mL/min；流動相：水/甲醇(4/96，V/V)。

圖1 葉黃素標(biāo)準(zhǔn)色譜Fig.1 Standard chromatogram of lutein

2 結(jié)果與討論

2.1 選定檢測波長

本儀器配備的是光電二極管陣列檢測器，在檢測的同時，還可以獲取葉黃素的紫外可見吸收光譜圖。葉黃素的最大吸收波長為446 nm，選定446 nm作為檢測波長。

2.2 優(yōu)化流動相

在現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法中[9]，葉黃素的流動相為甲醇/水/叔丁基甲基醚。叔丁基甲基醚易揮發(fā)，有刺激性氣味。優(yōu)化后的流動相為水/甲醇(4/96，V/V)，該條件簡單易行，環(huán)境友好。葉黃素標(biāo)準(zhǔn)色譜見圖1。

2.3 樣品前處理方法選擇

2.3.1 葉黃素單體選用超聲波輔助提取法

提取劑的選擇：葉黃素為脂溶性，可溶于大部分有機溶劑，分別選取甲醇、無水乙醇、丙酮和乙腈為提取劑。前處理過程同“1.3.1節(jié)”。結(jié)果表明：含油樣品，丙酮溶解性最好，提取率最高；對于非含油樣品，甲醇和無水乙醇提取率接近，綜合考慮，選用無水乙醇為提取劑。

提取劑中BHT濃度 ：由于葉黃素的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，需要在提取劑中添加BHT抗氧化劑。前期研究工作表明提取劑中含0.15 %BHT時，提取率最佳[18]。

2.3.2 葉黃素微囊粉選用酶解—超聲波提取法

在酶解過程中，需要水浴加熱，加入抗壞血酸可減少葉黃素的氧化分解[19]。

水溶性壁材：該類壁材遇水即溶，因此加水破壁即可。水用量分別選擇5.0、10.0、15.0、20.0 mL，其他參數(shù)條件不變(樣品為乳基幼兒配方奶粉，稱樣量為2.0 g)，具體詳見“1.3.2節(jié)”。每個水平重復(fù)2次，取平均值，得出水用量與葉黃素含量的關(guān)系見圖2。

水用量過少，不能充分溶解樣品和破除微囊壁；水用量過多，影響葉黃素提取率和基質(zhì)沉淀率。由圖2可知，水用量為15.0 mL時，測得葉黃素含量最高，選定水用量15.0 mL。由于樣品中葉黃素微囊粉含量不同，最佳水用量也不同，因此，測定不同含量的樣品，需要重新優(yōu)化水的用量。

蛋白質(zhì)壁材：選擇胰蛋白酶破除微囊壁。酶用量分別選擇0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g，其他參數(shù)條件不變(樣品為葉黃素微囊粉，稱樣量為0.05 g)，具體詳見“1.3.2 節(jié)”。每個水平重復(fù)2次，取平均值，得出酶用量與葉黃素含量的關(guān)系見圖3。

圖2 水用量對葉黃素含量的影響
Fig.2 Effect of water dosage ondetermining lutein content

圖3 酶用量對葉黃素含量的影響
Fig.3 Effect of enzyme dosage ondetermining lutein content

由圖3可知，酶用量分別為0.15、0.20、0.25 g時，測得葉黃素含量基本相同?？紤]到實驗成本，選定酶用量0.15 g。由于樣品中葉黃素微囊粉含量不同，最佳酶用量也不同，因此，測定不同含量的樣品，需要重新優(yōu)化酶用量。

2.3.3 葉黃素酯選用的堿皂化—液液萃取法

葉黃素酯選用的堿皂化—液液萃取法已經(jīng)成熟，前處理方法參考相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)方法即可，具體步驟見“1.3.3節(jié)”。

2.4 方法的線性范圍和檢出限

在優(yōu)化條件下，考察了葉黃素的線性范圍和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示：葉黃素在0.125～10.0 mg/L范圍內(nèi)，線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 91。對于奶粉和蛋白粉等食品，當(dāng)取樣量為2.0 g、定容體積為5 mL 時,檢出限為0.10 mg/kg(信噪比S/N=3)。

2.5 方法的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

采用“1.3節(jié)”測定樣品中葉黃素含量，每個加標(biāo)濃度均做平行樣。求得加標(biāo)回收率為90.0 %～ 102.2 %。平行 6 次實驗，求得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 2.29 % ～ 5.84 %，具體結(jié)果見表1。

表1 葉黃素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.1 Recoveries and RSDs of lutein in the samples

2.6 食品中葉黃素的含量情況

通過對820個樣品進行含量測定，結(jié)果表明，在所檢測的樣品中所含葉黃素含量均不同：①不同品牌、不同年齡段的食品中葉黃素含量不同；②葉黃素軟膠囊的原料為葉黃素單體，硬膠囊為葉黃素微囊粉；③雞蛋中葉黃素主要在蛋黃里，雞的食源種類對蛋黃中葉黃素含量影響很大；④葉黃素微囊粉的壁材主要為水溶性壁材；⑤天然作物中可能同時含有葉黃素單體和葉黃素酯。樣品前處理要參照“1.3.3節(jié)”。選取有代表性的樣品進行列表，按葉黃素形態(tài)不同分為3個表，具體結(jié)果分別見表2～表4。

表2 葉黃素單體食品中的檢測結(jié)果Tab.2 Test results of lutein in lutein monomer foods

表3 葉黃素微囊粉食品中的檢測結(jié)果Tab.3 Test results of lutein in lutein microcapsules foods

表4 葉黃素酯食品中的檢測結(jié)果Tab.4 Test results of lutein in lutein esters foods

3 結(jié)論

本文根據(jù)樣品基質(zhì)和葉黃素形態(tài)不同，分別建立了超聲波輔助提取法、酶解-超聲波提取法、堿皂化-液液萃取法，同時對其色譜條件進行了優(yōu)化。通過對實際樣品進行測定，結(jié)果表明該方法適用范圍廣、針對性強、準(zhǔn)確度高和重現(xiàn)性好，可滿足各類食品中葉黃素的檢測。通過對市售的820個樣品進行測定，總結(jié)了常見樣品中葉黃素的存在形式，明確了各類樣品中葉黃素的含量情況，為消費者選擇提供數(shù)據(jù)參考。