LC-MS/MS法測定柚子皮中香豆素類物質組成及含量

郝元元

（烏蘭察布職業(yè)學院，內蒙古烏蘭察布012000）

柚[Citrus maxima（Burm）Merr.]為蕓香科柑橘屬喬木，在東南亞各國以及我國長江以南各地均有栽培，且品種繁多，因柚子果肉口感酸甜，富含維生素C，具有消食、理氣、解酒毒等功效而深受人們喜愛[1-3]，但柚經食用或加工后每年都生產大量的柚子皮，除部分柚子皮被制成藥材，大部分柚子皮被丟棄，既浪費資源，又污染環(huán)境。目前國內外科學工作者已報道柚子皮中含有活性多糖、黃酮類化合物、膳食纖維、柚子皮黃色素、柚子皮精油、果膠、柚皮苷等功效成分[4-9]。而蕓香科柑橘屬植物廣泛含有香豆素及其衍生物，即一類具有芳香性氣味的物質，結構類型多樣，具有多種活性，是醫(yī)藥、農藥、染料等精細化工產品的原料和中間體[10-14]。古淑儀等[11]采用X 射線單晶衍射儀測定化州柚未成熟干燥幼果中3 個7-甲氧基香豆素；胡甜恬等[12]采用多種色譜層析分離純化，經波譜分析新鮮沙田柚皮的95 %乙醇提取物中分離得到10 個香豆素類化合物；王輝等[13]采用高效液相色譜-質譜法測定沙田柚果肉汁中6 種呋喃香豆素類化合物，而關于柚子皮中香豆素及其衍生物的研究報道較少[14-15]。本研究采用堿性甲醇超聲萃取香豆素及其衍生物，經C18柱分離，采用液相色譜－質譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS/MS）對柚子皮中8 種香豆素及其衍生物含量進行質譜檢測，為農業(yè)廢棄物柚子皮的綜合開發(fā)利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、材料

Waters ACQUITY Xevo TQ MS 型高效液相色譜儀-三重四級桿質譜儀：美國Waters 公司；BS224S 型電子天平：德國Sartorius 公司MM400 型研磨儀：德國RETSCH 公司；MixPlus 渦旋混合儀：合肥艾本森科學儀器有限公司；YQ-1000C 型超聲波清洗器：上海易凈超聲波儀器有限公司；Rotavapor R-210 旋轉蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI 公司；ULUP-Ⅱ型超純水機：西安優(yōu)普儀器設備有限公司。

8 種香豆素及其衍生物標準物質：香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6－甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、環(huán)香豆素、醋硝香豆素、雙香豆素：純度均≥98%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司，具體信息見表1；甲酸、乙酸銨：均為色譜純，美國Sigma 公司；甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷：均為色譜純，美國Tedia 公司；其余試劑均為分析純：西隴化工股份有限公司；試驗用水均為超純水。

表1 香豆素及其衍生物標準物質信息Table 1 Standard substance information of coumarin and its derivatives

香豆素及其衍生物標準儲備液（10.0 mg/mL）：分別準確稱取香豆素及其衍生物0.1 g（精度至0.1 mg），用少量甲醇溶解后定容至10 mL 容量瓶中，-20 ℃保存。

6 份不同產地的柚子，產地分別為廣東梅州（沙田柚）、廣東化州（化州柚）、浙江蒼南（四季柚）、浙江常山（常山胡柚）、福建漳州（琯溪蜜柚）、重慶墊江（墊江白柚），剝去果肉后，將柚子皮置于恒溫干燥箱中，70 ℃烘干24 h，粉碎，過100 目篩后備用。

1.2 LC-MS/MS條件

液相色譜條件：Waters XBrigde C18色譜柱（150 mm×4.6mm，3.5μm）；流動相 A 為乙腈，流動相 B 為 0.05mol/L乙酸銨溶液（含0.1 %甲酸）；柱溫為30 ℃；流速為0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相梯度洗脫條件見表2。

表2 梯度洗脫條件Table 2 The mobile phase gradient program

質譜條件：電離方式為電噴霧電離（electron spray ionization，ESI），采用正離子（ESI+）和負離子（ESI-）模式掃描，采用多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式進行監(jiān)測；離子源溫度為500 ℃。ESI+模式時：毛細管電壓為3.5 kV，錐孔氣流速為50 L/h，脫溶劑氣溫度為350 ℃，去溶劑氣流量為700 L/h；ESI-模式時：毛細管電壓為2.2 kV，錐孔氣流速為50 L/h，脫溶劑氣溫度為400 ℃，去溶劑氣流量為800 L/h。8 種香豆素及其衍生物的電離方式、母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數見表3。

表3 香豆素及其衍生物的質譜參數Table 3 Mass spectrometric parameters of coumarin and its derivatives

1.3 樣品前處理

準確稱取柚子皮粉5 g（精度至0.1 mg）置于100 mL離心管中，加入20 mL 甲醇，渦旋混合后，在超聲波水浴中超聲提取30 min，以10 000 r/min 離心5 min，收集上清液；殘渣用20 mL 甲醇超聲提取2 次，合并上清液，35 ℃旋轉蒸發(fā)濃縮至5 mL；濃縮液經Oasis HLB固相萃取柱凈化，凈化液經0.22 μm 濾膜過濾，濾液供LC-MS/MS 測定。

1.4 標準工作曲線的繪制

分別移取香豆素及其衍生物標準儲備液（10.0 mg/mL）適量置于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋配制成質量濃度依次為 0.01、0.05、0.10、0.50、1.0 μg/mL的香豆素及其衍生物混合標準工作溶液，經LC-MS/MS 測定，以香豆素及其衍生物標準工作溶液質量濃度為橫坐標，以其相對應的色譜峰響應值為縱坐標，繪制標準工作曲線。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用注射泵將1.0 μg/mL 的香豆素及其衍生物單標連續(xù)直接進樣，采用正負離子模式進行全掃描，以選擇準分子離子（母離子）和電離方式。結果表明：雙香豆素和醋硝香豆素在電噴霧負離子（ESI-）電離方式下，可獲得響應值較高的[M-H]-母離子；香豆素、7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、6－甲基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、環(huán)香豆素在電噴霧負正離子（ESI+）電離方式下，可獲得響應值較高的[M+H]+母離子；采用子離子掃描方式對母離子進行二級質譜分析，通過優(yōu)化毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量等質譜參數，使得8 種香豆素及其衍生物的母離子及其子離子的相對強度達到最大，將響應值最大的子離子設為定量離子，響應值較穩(wěn)定的子離子設為定性離子，8 種香豆素及其衍生物的質譜參數信息具體見表3，質譜總離子流圖見圖1。

2.2 色譜柱的選擇

分別考察了Waters XTerra MS C18、Waters XBrigde C18、Hypersil BDS C18、Symmetry C18等不同微粒填料的色譜柱對8 種香豆素及其衍生物的分離效果（圖1）。結果表明：在不同型號的C18柱上，8 種香豆素及其衍生物的分離效果存在顯著性差異，特別是當采用Wa－ters XBrigde C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）色譜柱時，各化合物的色譜峰更為符合正態(tài)分布，且分離效果好，響應值較高，故選擇Waters XBrigde C18作為分析柱。

圖1 香豆素及其衍生物標準溶液的質譜總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of coumarin and its derivatives

2.3 流動相的選擇

采用Waters XBrigde C18作為分析柱，分別考察甲醇/乙腈和不同濃度的乙酸銨溶液為流動相體系時對香豆素及其衍生物的色譜分離及其離子化響應情況。試驗結果顯示，香豆素及其衍生物的質譜響應值和保留時間隨著乙酸銨濃度的改變而發(fā)生變化，當乙酸銨濃度為0.05 mol/L 時，基線平穩(wěn)，峰形對稱，且保留時間適中，特別是當0.05 mol/L 乙酸銨溶液中添加0.1%甲酸時，可提高香豆素及其衍生物的質譜響應值和靈敏度（圖1）。故選擇乙腈-0.05 mol/L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）作為流動相。

2.4 萃取溶劑的選擇

考察甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、正己烷等萃取溶劑對8 種香豆素及其衍生物的萃取效果見圖2。

圖2 萃取溶劑對香豆素及其衍生物的萃取效果Fig.2 Effect of extraction solvent on the effect of coumarin and its derivatives

從圖2可以看出：按8 種香豆素及其衍生物平均萃取率大小依次排序為：甲醇（96.2%）＞乙腈（91.5%）＞乙酸乙酯（88.4 %）＞二氯甲烷（84.1 %）＞正己烷（67.3%），其中甲醇對8 種香豆素及其衍生物的萃取率在87.6%～99.4%之間，平均值為96.2%。故選擇甲醇作為萃取溶劑。

2.5 凈化柱的選擇

考察WCX（弱陽離子柱）、WAX（弱陰離子柱）、MCX（混合型陽離子柱）、MAX（混合型陰離子柱）、HLB（親水-親酯柱）、AluN（中性氧化鋁柱）等不同極性固相萃取柱對8 種香豆素及其衍生物的凈化效果見圖3。

從圖3中可知，HLB（親水-親酯柱）對8 種香豆素及其衍生物的平均凈化率最高（平均凈化率為96.3%），這可能是因為HLB 具有親水-親酯平衡化學結構，對不同極性的香豆素及其衍生物混合物具有良好的均衡吸附作用。故選擇HLB 作為凈化柱。

圖3 不同固相萃取柱對香豆素及其衍生物平均凈化率的影響Fig.3 Effect of solid phase extraction column on the recovery rate of coumarin and its derivatives

2.6 基質效應

為提高本文所建LC-MS/MS 法的特異性和降低樣品基質對香豆素及其衍生物含量測定的影響，考察了香豆素及其衍生物在柚子皮萃取液和純乙腈兩種不同基質中的響應值比值來衡量基質效應（matrix effect，ME）。ME/%=A/B×100%，其中 A 為柚子皮萃取液中香豆素及其衍生物的響應值，B 為純乙腈中香豆素及其衍生物的響應值；若ME＞10%，表明存在基質增強效應；若-10%＜ME＜10%，表明不存在基質干擾效應；若ME＜-10%時，表明存在基質減弱效應。結果表明，在柚子皮萃取液和純乙腈兩種基質中分別加入10.0、500.0、1 000.0 μg/kg 3 種低中高濃度的 8 種香豆素及其衍生物標準混合溶液，經本文所建LC-MS/MS法測定柚子皮中8 種香豆素及其衍生物的基質效應ME 值在-3.7%～4.6%見表4，這表明不存在基質干擾效應。

表4 香豆素及其衍生物在純乙腈和柚子皮中的基質效應Table 4 Matrix effect of coumarin and its derivatives in pure acetonitrile and Citrus maxima

2.7 線性范圍和檢出限

在空白柚子皮中添加不同濃度的香豆素及其衍生物標準儲備液，按“1.3 樣品前處理”和“1.2 HPLCMS/MS 條件”進行測定，以香豆素及其衍生物標準工作溶液質量濃度為橫坐標（x，mg/mL），以其相對應的色譜峰響應值為縱坐標（y，cps），繪制標準工作曲線，計算回歸方程；在空白柚子皮中添加一系列低濃度的香豆素及其衍生物混合標準工作溶液，按“1.3 樣品前處理”和“1.2 HPLC-MS/MS 條件”進行測定 11 次，分別以 3 倍信噪比（S/N=3）和 10 倍信噪比（S/N=10）計算方法檢出限（LODs）和定量限（LOQs）見表5。

表5 線性范圍、相關系數、檢出限及定量限（n=6）Table 5 Linear range，correlation coefficients，limits of detection and limits of quantitation（n=6）

從表5中可知：在 0.010μg/mL～1.0 μg/mL 范圍內，香豆素及其衍生物具有良好的線性關系（R2≥0.999 5）；LODs 在 3.0 μg/kg ～4.5 μg/kg；LOQs 在 10.0 μg/kg ～15.0 μg/kg。

2.8 加標回收率與精密度

分別在空白柚子皮中添加10.0（低濃度）、500.0（中濃度）、1 000.0 μg/kg（高濃度）3 種水平的香豆素及其衍生物混合標準工作溶液，按“1.3 樣品前處理”和“1.2 HPLC-MS/MS 條件”進行加標回收率和精密度測定見表6。

從表6中可知，香豆素及其衍生物的平均加標回收率為90.4%～98.5%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為 0.9 %～4.1 %，該方法的準確度、精密度均符合方法學的要求。

表6 加標回收率和精密度（n=6）Table 6 Recoveries and precision（n=6）

2.9 實際樣品的檢測

將6 份來自不同產地的柚子皮（沙田柚、化州柚、四季柚、常山胡柚、琯溪蜜柚、墊江白柚），按“1.3 樣品前處理”和“1.2 HPLC-MS/MS 條件”進行測定柚子皮中香豆素及其衍生物的組成及其含量見表7。

表7 實際柚子皮中香豆素及其衍生物的組成及其含量Table 7 Composition and content of coumarin and its derivatives in Citrus maxima

從表7中可知，柚子皮中含有一定量的香豆素及其衍生物，這與古淑儀等[11]、王輝等[13]關于柚子皮中香豆素及其衍生物的研究報道一致；6 種不同品種的柚子皮中均含有7-甲氧基香豆素，且7-甲氧基香豆素含量較高，含量在 11.4 μg/kg～123.7 μg/kg，而 7-甲氧基香豆素具有一定的生物活性的藥物，具有平喘、祛痰、鎮(zhèn)咳的作用，該成分可能與柚子具有的暖胃、化痰、潤化喉嚨等食療作用相關；在所檢的6 種柚子皮中，均未檢出香豆素、6-甲基香豆素、環(huán)香豆素、雙香豆素；不同品種的柚子皮中含有的香豆素及其衍生物不同，這可能與品種、氣候、貯藏時間等因素不同而引起的差異，可為農業(yè)廢棄物柚子皮的綜合開發(fā)利用提供科學依據。

3 結論

針對6 份不同產地的柚子皮，經甲醇超聲提取，Oasis HLB 固相萃取柱凈化，Waters XBrigde C18色譜柱分離，以乙腈和0.05 mol/L 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）為流動相進行梯度洗脫，采用多反應監(jiān)測檢測，建立了液相色譜-質譜法測定柚子皮中8 種香豆素及其衍生物的檢測方法。結果表明：在0.010 μg/mL～1.0 μg/mL范圍內，香豆素及其衍生物具有良好的線性關系（R2≥0.999 5）；方法檢出限在 3.0 μg/kg～4.5 μg/kg，定量限在10.0 μg/kg～15.0 μg/kg；加標回收率在 90.4%～98.5%，相對標準偏差在0.9%～4.1%；在6 種不同品種的柚子皮中檢出7-甲基香豆素、7-甲氧基香豆素、7-乙氧基-4-甲基香豆素、醋硝香豆素，其中7-甲氧基香豆素含量較高，含量在 11.4 μg/kg～123.7 μg/kg，該成分可能與柚子具有暖胃、化痰、潤化喉嚨等食療作用相關，這為柚子皮綜合開發(fā)利用提供參考。