濃縮果汁中游離糖的組成分析

李開(kāi)，曾鳴，宋昊，王冬

（1.北京一輕研究院，北京 101111；2.北京市食品工業(yè)研究所，北京 100075）

糖類(lèi)在植物體的結(jié)構(gòu)和功能方面起著非常重要的作用，不僅是植物生長(zhǎng)過(guò)程中的能量來(lái)源和物質(zhì)基礎(chǔ)，還是糖代謝和基因表達(dá)過(guò)程中通過(guò)糖感知系統(tǒng)調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)的信號(hào)[1-2]。糖類(lèi)是食品中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)對(duì)食品的風(fēng)味、甜味、質(zhì)構(gòu)和穩(wěn)定性有一定的影響，其種類(lèi)和含量直接影響食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。最近幾年，我國(guó)果汁飲料加工業(yè)發(fā)展迅速，已經(jīng)成為了全球最大的濃縮果汁生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，濃縮果汁的品質(zhì)控制顯得尤其重要。糖類(lèi)是濃縮果汁的主要成分，糖類(lèi)的組成成分影響著濃縮果汁的甜味，同時(shí)糖類(lèi)也是濃縮果汁中可溶性固形物的重要組成[3]，所以監(jiān)測(cè)濃縮果汁中糖類(lèi)的組成對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的控制有著重要意義。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)糖含量的分析方法包括化學(xué)法和儀器分析法，化學(xué)法有直接滴定法、高錳酸鉀滴定法、鐵氰化鉀法、奧氏試劑滴定法測(cè)定食品中的還原糖[4]和總糖，雖然化學(xué)法相對(duì)便宜、準(zhǔn)確度高，但是耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、無(wú)法準(zhǔn)確定性糖的種類(lèi)。儀器分析法包括分光光度法[5]、毛細(xì)管電泳法（capillary electroph-oresis，CE）[6-7]和色譜法，分光光度法和化學(xué)法一樣不能確定糖的種類(lèi)；糖類(lèi)既不帶電，也沒(méi)有紫外吸收和熒光特性，使用CE 檢測(cè)糖類(lèi)化合物需要讓糖帶電或者衍生化，技術(shù)要求較高，操作耗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果重現(xiàn)性較差；色譜法種類(lèi)較多，主要有離子交換色譜法[8-9]（ion exchange chromatography，IEC）、氣相色譜法[10-11]（gas chromatography，GC）和高效液相色譜法[12-14]（high performance liquid chromatography，HPLC），IEC 靈敏度高，但是糖類(lèi)在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性不夠好，另外設(shè)備昂貴；糖類(lèi)化合物沸點(diǎn)高、難揮發(fā)、難氣化和熱穩(wěn)定差，不能直接用GC 進(jìn)行分析，需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化處理、需用有毒試劑、操作比較復(fù)雜、穩(wěn)定性差[15]；相比之下，HPLC 具有簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、樣品前處理容易等優(yōu)勢(shì)，因此成為了食品中糖分離鑒定、定量分析的主要手段。由于糖類(lèi)在紫外可見(jiàn)光區(qū)無(wú)吸收以及無(wú)熒光特性，將二極管陣列檢測(cè)器（diode array detector，DAD）和熒光檢測(cè)器（fluorescence detector，F(xiàn)LD）應(yīng)用于糖類(lèi)的檢測(cè)需要將糖進(jìn)行衍生化處理[16-17]，這就使分析流程變得復(fù)雜，降低了其通用性；相比其他檢測(cè)器，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（evaporative light-scattering detector，ELSD）和示差折光檢測(cè)器（differential refraction detector，RID）在糖類(lèi)的分析中應(yīng)用得最廣[18]，雖然ELSD 相對(duì)于RID 靈敏度更高、基線更穩(wěn)定，但是ELSD 更昂貴、操作更復(fù)雜，所以在滿(mǎn)足定性定量的基本前提下，日常生產(chǎn)過(guò)程中糖的檢測(cè)分析使用RID 更具優(yōu)勢(shì)。

本文采用HPLC-RID，建立了快速、準(zhǔn)確地分離分析木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的方法，為濃縮果汁中游離糖的檢測(cè)、監(jiān)管提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

配備 G1311C 泵、G1329B 進(jìn)樣器、G1316A 柱溫箱和G1362A 示差折光檢測(cè)器的1260 高效液相色譜系統(tǒng)：安捷倫科技有限公司；HF-2000R 高速離心機(jī)：上海利鑫堅(jiān)離心機(jī)有限公司；HC-C18萃取小柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

濃縮桔汁、濃縮橙汁：南充佳美食品工業(yè)有限公司；濃縮蘋(píng)果汁：天水長(zhǎng)城果汁集團(tuán)有限公司；乙腈（色譜純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖（含量≥99%）：Sigma-Aldrich LLC.；超純水（電阻率為 18.2 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX Carbohydrate Analysis Column（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為 75 ∶25 的乙腈-水；流速為 1.3 mL/min；柱溫為 35 ℃；RID 溫度為 35 ℃；進(jìn)樣量為 5 μL。

1.2.2 樣品前處理

稱(chēng)取樣品2 g～5 g，用超純水溶解，定容至50 mL，然后10 000 r/min 離心20 min，取上清液備用。為了除去樣品中可能影響到目標(biāo)物分析的諸如有機(jī)酸、色素等雜質(zhì)，本文將樣品溶液經(jīng)過(guò)C18萃取小柱進(jìn)行凈化處理，首先將C18萃取小柱先用2 mL 甲醇活化，然后用2 mL 超純水沖洗以去除甲醇，取5 mL 離心后的上清液至萃取小柱，棄去開(kāi)始的2 mL 流分，收集后續(xù)溶液，用孔徑為0.45 μm 的濾膜過(guò)濾，濾液待分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜峰的確定

按照1.2.1 的色譜條件，測(cè)定6 種糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到如圖1所示的色譜圖，然后分別測(cè)定每種糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，確定每種糖的保留時(shí)間，最終得到各組分的出峰順序?yàn)槟咎?、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖?/p>

圖1 糖標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the sugar standards

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 流動(dòng)相比例的選擇

改變流動(dòng)相乙腈和水的比例，其他條件不變（流速為1.0 mL/min，為了保持RID 狀態(tài)穩(wěn)定，柱溫與RID溫度一致為 30 ℃）。分別考察在乙腈/水為 70 ∶30、75 ∶25、80 ∶20 時(shí)對(duì)6 種糖的分離效果的影響，得到的色譜圖如圖2所示。

隨著乙腈的濃度增大，分離度逐漸增大，但是保留時(shí)間也逐漸增大，峰寬逐漸加大；流動(dòng)相比例為70 ∶30 時(shí)，果糖和葡萄糖沒(méi)有完全分離，峰形較差，隨著乙腈比例的增大，分離效果變好，75 ∶25 時(shí)完全分離，并且峰形都較好，如果繼續(xù)增大乙腈的比例，峰的展寬加重且分離時(shí)間變長(zhǎng)。綜合分離時(shí)間與分離度，選擇75 ∶25 為流動(dòng)相比例。

2.2.2 測(cè)試溫度的選擇

柱溫是色譜分析的一個(gè)重要參數(shù)，直接影響化合物的分離度和分析速度。為了考察柱溫對(duì)分離6 種糖的影響，保持流動(dòng)相比例（乙腈∶水=75 ∶25）、流速（1.0 mL/min）不變，控制分析溫度為 25、30、35、40 ℃，分離結(jié)果如圖3所示。

圖2 不同流動(dòng)相比例時(shí)糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of the sugar standards in different volume ratios of the mobile phases

圖3 不同分析溫度時(shí)糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of the sugar standards analyzed in different temperatures

隨著溫度的升高，各化合物的保留時(shí)間逐漸變短，但是分離度和保留時(shí)間變化都不是太明顯，綜合考慮選擇35 ℃為分析溫度。

2.2.3 流速的選擇

根據(jù)van Deemter 速率理論方程式H=A+B/u+Cu（A、B、C 為常數(shù)，H 為理論塔板高度，u 為流動(dòng)相線速度），在一定范圍內(nèi)，隨著流速的降低，H 降低、柱效升高、分離度變大，但是流速過(guò)低時(shí)，分析時(shí)間變長(zhǎng)、柱效反而降低；提高流速可以縮短分離時(shí)間，但是流速過(guò)高時(shí)，待分析化合物來(lái)不及分離就被洗脫出，柱效就會(huì)降低，分離效果變差。保持流動(dòng)相比例（乙腈∶水=75 ∶25）、溫度（35 ℃）不變，考察流速為 1.0、1.3、1.5 mL/min 時(shí)6 種糖的分離情況，如圖4所示。

圖4 不同流速時(shí)糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of the sugar standards analyzed on different flow rates of the mobile phase

在3 種流速下，6 種糖的分離效果都較好，隨著流速的升高，分析時(shí)間顯著縮短。另外，流速升高增大，柱壓會(huì)隨之升高，會(huì)影響色譜柱壽命，從1.3 mL/min 到1.5 mL/min 分析時(shí)間差別較小，所以最終確定1.3 mL/min為流動(dòng)相速度。

2.3 樣品前處理

濃縮果汁的組成非常復(fù)雜，含有糖類(lèi)、色素、酚類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)等化合物，色素、酚類(lèi)和有機(jī)酸類(lèi)化合物的疏水性比糖類(lèi)化合物強(qiáng)，容易吸附在色譜柱上不被洗脫，長(zhǎng)期這樣會(huì)降低色譜柱的柱效，縮短色譜柱的壽命，所以正式分析前應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。HCC18萃取小柱的填料具有較高的疏水性，糖類(lèi)化合物在柱子上很難保留，而色素等干擾物質(zhì)相較于待測(cè)化合物的疏水性強(qiáng)、在柱子上保留強(qiáng)，從而可以?xún)艋瘶悠啡芤?。濃縮蘋(píng)果汁樣品凈化前后的對(duì)比效果見(jiàn)圖5，經(jīng)固相萃取后色素去除完全，待測(cè)化合物的峰形、峰面積沒(méi)有影響，柱壓明顯降低，說(shuō)明該方法能簡(jiǎn)單快速凈化果汁待測(cè)樣品。

圖5 樣品處理前后的效果Fig.5 The results before and after treatment of samples

2.4 方法的驗(yàn)證

配制6 種糖的一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化過(guò)的分析條件進(jìn)樣測(cè)試，同一濃度分析3 次，對(duì)峰面積（y）和濃度（x）進(jìn)行擬合，得到6 種糖的線性方程和相關(guān)性系數(shù)（如表1所示），線性范圍較寬，R2＞0.999 0。

表1 方法的線性方程Table 1 Linear equations of six sugars

為了研究方法的重現(xiàn)性，按優(yōu)化后的色譜條件，將6 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，分別計(jì)算每種化合物保留時(shí)間（tR）和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），結(jié)果見(jiàn)表2，tR的 RSD 為0.05%～0.07%，峰面積的RSD 為0.77%～4.54%；另外，為了研究方法的穩(wěn)定性，連續(xù)6 d 對(duì)6 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)試，分別計(jì)算每種化合物的tR和峰面積的 RSD，結(jié)果見(jiàn)表2，tR的 RSD 為 0.41%～1.75%，峰面積的RSD 為1.39%～2.99%。以上結(jié)果說(shuō)明方法重現(xiàn)性良好并具有較好的穩(wěn)定性，這可能是由于糖溶液比較穩(wěn)定、在不同日期檢測(cè)其含量波動(dòng)較小[19]。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 2 Results of the precision experiments（n=6）

為了檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度，以濃縮蘋(píng)果汁為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，向濃縮蘋(píng)果汁中加入24.575 mg/g 和48.750 mg/g 的混合標(biāo)樣，然后根據(jù)優(yōu)化后的條件進(jìn)行測(cè)試，平行分析3 次，結(jié)果見(jiàn)表3。

6 種糖的回收率在87.20%～105.22%，證明該方法準(zhǔn)確性較好。通過(guò)以上線性范圍、精密度和回收率結(jié)果可知，該方法準(zhǔn)確可靠，能滿(mǎn)足濃縮果汁中糖類(lèi)定性定量分析的要求，可以用于濃縮果汁品質(zhì)的控制。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用優(yōu)化后的條件對(duì)3 種濃縮果汁進(jìn)行分析，根據(jù)保留時(shí)間對(duì)樣品的色譜峰進(jìn)行定性，色譜圖見(jiàn)圖6。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4，濃縮蘋(píng)果汁、濃縮桔汁和濃縮橙汁中都只檢出果糖、葡萄糖和蔗糖。其中，濃縮蘋(píng)果汁中，果糖含量＞葡萄糖含量＞蔗糖含量；而濃縮桔汁和濃縮橙汁中蔗糖含量＞果糖含量＞葡萄糖含量，柑橘汁中葡萄糖與果糖的含量比值基本上保持在0.85 與1 之間，這個(gè)指標(biāo)可以作為識(shí)別濃縮柑橘汁的真?zhèn)蝃3，20]，本文中被測(cè)濃縮桔汁和濃縮橙汁這個(gè)指標(biāo)分別為0.95 和0.90。

表3 濃縮蘋(píng)果汁中糖的加標(biāo)回收率（n=3）Table 3 Spiked recoveries of the six sugars in the concentrated apple juice（n=3）

圖6 濃縮果汁的液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of the concentrated juices

表4 3 種濃縮果汁中糖含量的測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 4 Contents of sugars in three concentrated juices（n=3）

3 結(jié)論

本文建立了HPLC-RID 同時(shí)分離分析木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖的方法，同時(shí)將該方法應(yīng)用到了濃縮果汁中游離糖的組分分析中。結(jié)果表明，本方法前處理簡(jiǎn)單，具有較寬的線性范圍，精密度、準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性良好，結(jié)果可靠，對(duì)濃縮果汁生產(chǎn)加工品質(zhì)監(jiān)控以及濃縮果汁原料真?zhèn)舞b別具有重要的應(yīng)用價(jià)值。