響應(yīng)面法優(yōu)化葛仙米多糖提取工藝

李洪權(quán)，柏玉冰，謝文劍，劉曉紅，劉飛波，張瑞華，周熙，*

（1.株洲市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南株洲412000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；3.安鄉(xiāng)縣中醫(yī)院，湖南常德415600；4.湖南省株洲炎帝生物責(zé)任有限公司，湖南株洲412000）

葛仙米（Nostoc sphaeroides Kützing）是藍(lán)藻門念珠藻科的一種低等單細(xì)胞藍(lán)藻，古名天仙菜、天仙米，俗稱水木耳[1]。據(jù)《綱目拾遺》記載，葛仙米“性寒，味甘爽”，具有“解熱，清膈，利腸胃”的功效[2]?，F(xiàn)代關(guān)于葛仙米的研究包括基礎(chǔ)物質(zhì)[3-4]、藥理活性[5-8]以及提取工藝[9-12]。通過(guò)對(duì)這些研究報(bào)道分析，葛仙米多糖以其含量最高、活性最強(qiáng)及研究報(bào)道最為詳盡為葛仙米中最重要的成分。而對(duì)葛仙米多糖的研究，提取為初始步驟，尤為重要。目前關(guān)于葛仙米多糖的提取研究，主要包括單因素、正交等[10]，而尚未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)面法提取葛仙米中多糖的工藝研究。

對(duì)于多糖的定量方式有多種，如比色法、滴定法、高效液相色譜法、氣相色譜法等，其中對(duì)多糖水解后的單糖衍生物用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定的方法簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好[13]。因此，本研究特選此方法并基于響應(yīng)面法優(yōu)化葛仙米多糖的浸提工藝，為后續(xù)葛仙米及其多糖的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

葛仙米：湖南炎帝生物科技有限公司；葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、95%乙醇（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

水浴鍋（HWS24）：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；離心機(jī)（ST16R）：賽默飛世爾科技公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000B）：上海亞榮生化儀器廠；高效液相色譜儀（Uitimate 3000）：賽默飛世爾科技公司；電子天平（XSE 205DV）：梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；超聲儀（HNS-SY-150）：北京同德創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜方法的建立

色譜柱：Welch Xtimate（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm，柱溫：30℃，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL，流動(dòng)相：以 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（用3 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至6.7）為流動(dòng)相A，乙腈為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流動(dòng)相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedure of mobile phase

2.2 樣品、標(biāo)準(zhǔn)品的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別精密稱取甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖及巖藻糖標(biāo)準(zhǔn)品100mg于10mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得9種單糖的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再配置成濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L 的不同濃度梯度單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取100 μL的單糖標(biāo)準(zhǔn)液及不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加200 μL、0.6 mol/L的NaOH溶液，置于10 mL的具塞試管中，漩渦混勻；再加400 μL、0.6 mol/L的PMP甲醇溶液，漩渦混勻，充入N2，在70℃的烘箱中避光反應(yīng)110 min，取出避光冷卻至室溫，加400μL、0.3mol/L的HCl溶液中和，加水至2 mL，再加等體積的氯仿，漩渦混勻，靜置，棄去氯仿相，如此萃取3次。將水相用0.45 μm微孔膜過(guò)濾后供高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析，得混標(biāo)如圖1所示，并經(jīng)軟件計(jì)處理得標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of mirture standards

表2 被測(cè)成分的線性關(guān)系、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equation，linear range and correlation of studied components

2.2.2 樣品的制備

提?。喝〗?jīng)60℃干燥至恒重的葛仙米，粉碎過(guò)4號(hào)篩后，取粉末約0.5 g，精密稱定，置于250 mL具塞錐形瓶中。加水以一定料液比，置于70℃水浴鍋中復(fù)水30 min后，水浴鍋調(diào)至單因素考察所需溫度，浸提考察所需時(shí)間見表3，適當(dāng)攪拌數(shù)次，浸提3次，合并浸提液。浸提液轉(zhuǎn)移至2 L圓底燒瓶中，70℃旋蒸濃縮至約50 mL。濃縮液轉(zhuǎn)移至500 mL具塞錐形瓶中，加入200 mL、95%乙醇，適當(dāng)振搖，靜置醇沉 12 h，離心，棄去上層殘液，殘?jiān)?jīng)真空干燥至恒重，備用。

表3 浸提考察條件Table 3 The inspection condition of extraction

溶解：精密稱取約0.15 g葛仙米浸提物于50 mL離心管中，加水20 mL，置于熱水浴中至浸提物完全溶解。

水解：取1 mL溶解液于10 mL具塞試管中，加入400 μL濃度為4 mol/L 三氟乙酸（TFA），充入 N2封管，在110℃烘箱中水解4 h，冷卻后，加2次2 mL甲醇，用N2吹干，重復(fù)兩次，去除TFA，精密加入0.1 mL水溶解，得水解樣品，待衍生。

衍生：同2.2.1。

2.2.3 含量計(jì)算

單糖總量Y總=Y1+Y2+Y3+Y4+Y5+Y6，單糖總量得率/%=Y總/葛仙米稱樣量×100。

2.3 單因素考察

2.3.1 料液比對(duì)提取率的影響

取0.5g葛仙米粉末，精密稱定，固定超聲時(shí)間1.5h，溫度為 100℃，分別以料液比 1∶100、1∶150、1∶200、1 ∶250、1 ∶300（g/mL）條件下按上述“2.2.2 樣品前處理”、“2.1色譜方法”以及“2.2.3含量計(jì)算”分析處理。料液比影響結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對(duì)提取率的影響Fig.2 Effect of material/water ratio on the extraction efficiency

由圖2可以看出在其他條件一定時(shí)，料液比為1∶100（g/mL）～1 ∶200（g/mL）對(duì)單糖總量得率影響顯著，隨著水的增大，單糖總量得率明顯增加；當(dāng)水超過(guò)200時(shí)，單糖總量得率隨著水的增加變化很小。因此，料液比的選擇，如果水的比值偏小，多糖浸提不徹底，水解衍生后單糖總量得率低；如果水比值偏大，對(duì)多糖的浸出沒(méi)有較大增加，單糖總量也不增加，反而使后續(xù)工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)料。

2.3.2 時(shí)間對(duì)提取率的影響

取0.5 g葛仙米粉末，精密稱定，固定料液比1∶200（g/mL），溫度為 100℃分別以時(shí)間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h條件下按上述“2.2.2樣品前處理”、“2.1色譜方法”以及“2.2.3含量計(jì)算”分析處理。時(shí)間影響結(jié)果見圖3。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.3 Effect of extracting time on the extraction efficiency

由圖3可知，在其他條件一定時(shí)，浸提時(shí)間0.5 h～1.5 h對(duì)單糖總量得率影響很大，隨浸提時(shí)間延長(zhǎng)，得率明顯增加；浸提時(shí)間1.5 h～2.5 h的多糖得率隨浸提時(shí)間增加而無(wú)明顯變化。

2.3.3 溫度對(duì)提取率的影響

取0.5 g葛仙米粉末，精密稱定，固定超聲時(shí)間1.5 h，料液比 1 ∶200（g/mL），分別以溫度為 80、85、90、95、100℃條件下按上述“2.2.2樣品前處理”、“2.1色譜方法”以及“2.2.3含量計(jì)算”分析處理。溫度影響結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對(duì)提取率的影響Fig.4 Effect of extracting temperature on the extraction efficiency

由圖4可知，在其他條件一定時(shí)，單糖總量得率隨著浸提溫度的升高，85℃～95℃急劇增加，95℃～100℃略微增加。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

本試驗(yàn)根據(jù)Design Expert 8.0軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)葛仙米單糖總量得率影響顯著的料液比（A）、浸提時(shí)間（B）和浸提溫度（C）為考察因素，用-1、0、1來(lái)表示低、中、高3個(gè)水平，以單糖總量得率（Y）為響應(yīng)值，因素水平表見表4，響應(yīng)面結(jié)果見表5。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 4 Factors and levels used in response surface design

表5 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 5 Response surface design arrangement and experimental results

續(xù)表5 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Continue table 5 Response surface design arrangement andexperimental results

利用Design Expert 8.0程序軟件對(duì)表5中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，對(duì)各因素回歸擬合后，得到多糖得率對(duì)水料比（A）、浸提時(shí)間（B）、浸提溫度（C）的三元二次回歸方程：Y=28.81+2.53A+2.36B+2.50C+0.77AB-0.12AC+0.11BC-2.50A2-2.52B2-3.76C2，方差分析見表6。

表6 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 6 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

從表6可看出，一次項(xiàng)中，A（料液比）和C（溫度）對(duì)單糖總量得率的線性效應(yīng)高度顯著，B（時(shí)間）對(duì)多糖含量的線性效應(yīng)極顯著，二次項(xiàng)中，A2、B2影響均極顯著，C2影響高度顯著，AB、AC、BC的交互影響不顯著。此模型顯著性檢測(cè)P值為0.000 4，高度顯著，失擬項(xiàng)P值為0.081 1，不顯著，校正模型的相關(guān)系數(shù)R2值為0.961 2，決定系數(shù)R2Adj值為0.911 3，說(shuō)明選用的模型與實(shí)際情況擬合較好、誤差小，能較好反應(yīng)出各因素與葛仙米多糖水解后單糖總量之間的關(guān)系。且由F值可知，在試驗(yàn)范圍內(nèi)各因素對(duì)多糖含量的影響大小依次為料液比＞浸提溫度＞浸提時(shí)間。兩因素交互作用對(duì)提取率影響的響應(yīng)面圖見圖5～圖7。

圖5 浸提時(shí)間與料液比交互效應(yīng)曲面圖Fig.5 Mutual domino effect bent surface mapping of extraction time and solid-liquid ratio

圖6 浸提溫度與料液比交互效應(yīng)曲面圖Fig.6 Mutual domino effect bent surface mapping of extraction temperature and liquid-solid ratio

圖7 浸提溫度與浸提時(shí)間的交互效應(yīng)曲面圖Fig.7 Mutual domino effect bent surface mapping of extraction temperature and time

由圖5～圖7可知，浸提時(shí)間、浸提溫度和料液比對(duì)葛仙米單糖總量都有顯著的影響。其中，料液比影響最為顯著，圖中曲面陡峭，隨著水的增加，單糖總量增加；浸提溫度的影響相對(duì)顯著，曲面較為陡峭；浸提時(shí)間影響次之。

葛仙米多糖適宜的提取工藝參數(shù)為浸提時(shí)間1.78 h、浸提溫度 96.66℃、料液比 1∶229.32（g/mL）。在此條件下，模型預(yù)測(cè)葛仙米單糖總量為30.64%?？紤]到實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中操作簡(jiǎn)便，將工藝條件修正為浸提時(shí)間 110 min，浸提溫度 97 ℃，料液比 1 ∶230（g/mL）；在此條件下，得到單糖總量得率為29.14%。已有相關(guān)報(bào)道中，莫開菊等[10]用熱水浴提取并進(jìn)行正交試驗(yàn)得出最佳條件為 90℃，提取 6 h，料液比為 1 ∶90（g/mL），提取4次，提取率為14.09%。其最佳條件和多糖得率均與本試驗(yàn)有較大差異。最為顯著的差異為液料比和提取時(shí)間，此差異可能主要源于與本試驗(yàn)設(shè)計(jì)方式和含量考察指標(biāo)的不同。但是本試驗(yàn)提取次數(shù)更少、提取時(shí)間更短。

3 結(jié)論

最終，通過(guò)回歸模型分析，以多糖水解后單糖總量得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，葛仙米多糖適宜的提取工藝參數(shù)為浸提時(shí)間110 min、浸提溫度97℃、料液比1∶230（g/mL）；在此條件下，得到單糖總量得率為29.14%，實(shí)際值與理論值基本相符，說(shuō)明模型對(duì)葛仙米多糖提取工藝條件參數(shù)優(yōu)化可靠可行，具有一定的實(shí)用價(jià)值。