響應面法優(yōu)化響鈴草總黃酮提取工藝及體外抗氧化活性研究

李燕，趙天明，黃麗榮，鄒濤，吳仙柳

（貴州理工學院，貴州貴陽550003）

響鈴草又名馬鈴草、腎氣草等，為豆科植物假地藍Crotalaria ferruginea Grah.的全草或帶根全草，性味微酸、寒，歸肺經，具有斂肺氣、止咳、消痰、定喘[1]的功效。可用于治療久咳痰血、耳鳴、耳聾、腎結石、慢性腎炎、膀胱炎、扁桃腺炎、淋巴腺炎、疔毒、惡瘡等[2]疾病，主要分布在西南地區(qū)，是當?shù)匕鬃濉⒁妥搴投弊宄Ｓ玫拿耖g藥材。黃酮類化合物是一類存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結構的化合物，具有改善血管的通透性、降低血脂和膽固醇的功效，用于治療心腦血管疾病?？傸S酮還具有抗肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等癌癥的功效，其抗腫瘤機制是由于總黃酮具有抗氧化和抗自由基的作用。自由基可損傷正常的細胞和組織，誘發(fā)疾病的出現(xiàn)，而天然產物黃酮可以有效對抗自由基以及抑制體內氧化酶的活性[3-4]。另外，總黃酮還具有抗菌、抗炎等活性[5-6]，作用廣泛?，F(xiàn)代研究也表明，冷水花、仙草和小春花等藥材中含有總黃酮化合物，且具有較好的抗氧化活性[7-9]。近年來，隨著人們對“綠色消費”、“回歸自然”理念的重視，大眾對含有植物提取物的食品、藥品、保健品、化妝品等產品的認可度不斷提升，天然植物提取物的商業(yè)價值越來越高，國際上對植物提取物的需求量也越來越大，中國是當今國際上主要植物提取物出口國之一，天然中藥材植物提取物占我國植物提取物中比例較大，因此中藥材植物提取物前景光明，市場寬廣[10]，如何將植物中的有效成分最大限度地提取出來顯得尤為重要。閃式提取主要是利用刀片將植物細胞組織進行破碎，同時應用高速攪拌和振動使其有效成分能充分溶解于溶劑中，與傳統(tǒng)的回流提取法相比較，閃式提取能夠在短時間內讓響鈴草中總黃酮類化合物快速浸出，將該提取方法運用到響鈴草總黃酮的提取研究中大大提高了提取速度，節(jié)約了時間。Box-Behnken響應面法是對影響因素進行設計，所得試驗結果進行方差分析、回歸分析，可實現(xiàn)設計試驗、回歸分析、預測優(yōu)化的功能，可用于設計和優(yōu)化提取工藝參數(shù)。目前，響鈴草總黃酮提取工藝雖有報道，但本試驗采用閃式提取，方法較簡單。為了獲得較多的總黃酮提取物，并對其生物活性進行檢驗，本試驗通過響應面法優(yōu)化總黃酮的提取工藝，在最佳提取工藝下進行抗氧化性試驗，為響鈴草植物提取物的工藝提取、后期開發(fā)和利用提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試藥

蘆丁對照品：中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201811；VC：上海申博化工有限公司，DPPH：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；所用試劑為分析純；水為蒸餾水；響鈴草藥材：成都荷花池中藥材市場

1.2 儀器

UH5300紫外可見分光光度計：日立（中國）有限公司；SD1102D分析天平：塞多利斯科學儀器有限公司；JHBE-50T閃式提取器：河南智晶生物科技股份有限公司；RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 響鈴草總黃酮閃式提取工藝優(yōu)化

1.3.1 總黃酮的含量測定

1.3.1.1 供試品溶液的制備

稱取10 g響鈴草藥材粉末（過5號篩），加入70%乙醇，1∶25（g/mL）的料液比，在閃式提取器中提取90 s，減壓抽濾，將濾液至于旋轉蒸發(fā)儀上，蒸發(fā)至無乙醇味為止，所得濃縮液用石油醚進行萃取，直至石油醚層不顯示綠色為止，棄去石油醚層，水層為總黃酮提取液，用70%乙醇定容至100 mL容量瓶中，搖勻，即得。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁對照品10 mg，加70%乙醇溶解，定容至50mL量瓶中，搖勻，制成0.2mg/mL對照品溶液。

1.3.1.3 標準曲線的繪制

精密量取“1.3.1.2”項下蘆丁對照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，置 10 mL 容量瓶中，分別加入 70%乙醇溶液2 mL，各精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，振搖后放置5 min，精密加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻后放置5 min，再精密加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，用70%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min，用與之相應的試劑為空白，于510 nm波長處測定吸光度，記錄不同濃度下的吸光度。以蘆丁含量（mg/mL）為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y）繪制標準曲線，并計算相關系數(shù)（R2）[11]。得回歸方程為Y=1.5646X+0.004 8（R2=0.999 3）。

1.3.1.4 重復性試驗

精密稱藥材粉末（過5號篩）6份，按“1.3.1.1”項下進行制備，取 1 mL，置于 10 mL量瓶中，按“1.3.1.3”項下顯色后測定各溶液中的吸光度。

1.3.1.5 精密度試驗

精密吸取“1.3.1.1”項下的總黃酮溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，顯色后平行測定6次吸光度。

1.3.1.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取“1.3.1.1”項下的總黃酮溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，顯色后，于 0、0.5、1、3、5、7 h 測定吸光度。

1.3.1.7 加樣回收率試驗

精密吸取6份總黃酮含量已知的供試品溶液1 mL，加入0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液適量，顯色后測定吸光度。

1.3.2 單因素試驗

稱取10 g藥材粉末（過5號篩）5份，放入提取容器中，每份以1∶25（g/mL）的料液比加入70%乙醇，分別考察在閃式提取器中提取 30、60、90、120、150 s 對響鈴草總黃酮提取效果的影響；根據(jù)以上方法固定其他因素考察最終所得總黃酮的含量，乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%，料也比分別為1∶25、1∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45（g/mL），從而獲得各條件下最佳提取工藝條件。

1.3.3 響應面優(yōu)化設計

在單因素試驗的基礎上，選擇對總黃酮提取效果影響較大的因素進行試驗，本試驗選擇三因素三水平采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Behnken進行設計，以響鈴草總黃酮的含量為響應值。因素水平如表1。

表1 因素水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件設計出的方案進行試驗，最后得出最優(yōu)提取工藝進一步進行試驗驗證，并與預測值比較。

1.4 體外抗氧化性試驗

1.4.1 DPPH自由基清除作用

參考文獻[12-13]，精密稱取DPPH 5 mg，用無水乙醇溶解并定容至100 mL棕色量瓶中，避光保存。以最優(yōu)條件提取的總黃酮提取液用無水乙醇分別稀釋為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，分別精密量取 2.0 mL總黃酮提取液與2.0 mL DPPH溶液混合搖勻，于室溫下反應，靜置20 min，作為樣品溶液，用無水乙醇調零，樣品放入吸收池中，在517 nm處測定吸光度（A1）。對照組為將相同體積的無水乙醇代替總黃酮提取液，按上述條件混合、反應和靜置，測定其在517 nm處的吸光度值（A0）?？瞻捉M為相同體積的無水乙醇DPPH溶液，按上述方法測定其在517 nm處的吸光度值（A2）。用相同濃度的VC溶液進行上述操作，作為陽性對照試驗。計算清除率，清除率/%=[1－（A1－A2）/A0）]×100。

1.4.2 還原力測定

參照文獻[14]稍加改進。分別取 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的總黃酮溶液1 mL，加入2.0 mL pH值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液和1.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，搖勻，用恒溫水浴鍋40℃下水浴30 min，于冷水中快速冷卻至室溫，加入1.0 mL 10%三氯乙酸，離心，取上清液1 mL置于錐形瓶中，再分別加入1 mL蒸餾水和0.1%三氯化鐵溶液，混合，搖勻，在室溫下靜置10 min，使之充分反應。以無水乙醇代替響鈴草總黃酮提取液按上述處理作空白對照，于700 nm處測定吸光度，以吸光度Abs表示還原能力。用同樣濃度VC溶液作為陽性對照。

1.4.3 羥自由基清除作用

參照杜麗清等[15]的方法進行響鈴草總黃酮羥自由基清除能力進行測定。以最優(yōu)條件提取的總黃酮提取液用無水乙醇分別稀釋為 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL，分別精密量取1.5 mL樣品，分別加入1 mL 2.5 mmol/L的水楊酸溶液、1 mL 5 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL蒸餾水，搖勻，使之充分混合，再加入1 mL 5 mmol/L的H2O2，置于35℃恒溫水浴鍋中反應20min，蒸餾水調零，溶液置吸收池中于510 nm波長處測定其吸光度（A1），用相同體積的蒸餾水代替H2O2按上述方法反應后測定吸光度（A2），用同體積蒸餾水代替總黃酮提取液反應后按上述方法測定吸光度（A0）。以同樣濃度的VC溶液作為陽性對照。羥自由基清除率/%=[1－（A1－A2）/A0]× 100。

2 結果與分析

2.1 總黃酮的含量測定結果

重復性試驗中吸光度的相對標準偏差RSD為1.9%，表明該方法重復性良好；精密度試驗中吸光度的相對標準偏差RSD為1.5%，表明儀器精密度良好；穩(wěn)定性試驗中吸光度的相對標準偏差RSD為1.8%，表明總黃酮溶液在顯色后7 h內穩(wěn)定性良好；加樣回收率試驗中吸光度的平均加樣回收率為98.99%，相對標準偏差RSD為1.2%，表明該方法可用于總黃酮的含量測定。

2.2 單因素試驗結果

提取時間、乙醇提取分數(shù)、料液比對總黃酮含量的結果見圖1。

由圖1A可知，隨著提取時間的增加，響鈴草總黃酮含量出現(xiàn)先增加后下降再上升的趨勢。當閃式提取時間在90 s時，總黃酮的含量最大，再繼續(xù)延長提取時間，總黃酮含量反而降低，這可能是由于部分不耐熱的黃酮類物質分解，故選擇提取時間為60、90、120 s作為響應面設計的因素。由圖1B可知，乙醇濃度小于60%時，總黃酮的含量隨乙醇體積分數(shù)的增加而增大。黃酮類化合物在花、葉、果等組織中一般以苷的形式存在，黃酮苷類一般可用乙醇等溶劑提??；當乙醇濃度高于60%時，總黃酮含量隨著乙醇體積分數(shù)的增加而降低，這可能是因為乙醇濃度過高，使植物細胞組織外的滲透壓過高，影響植物組織中總黃酮的浸出，故選擇乙醇濃度為50%、60%、70%作為響應面設計的因素。由圖1C可知，隨著料液比的增加，響鈴草總黃酮的含量出現(xiàn)先增加再降低的趨勢。主要是因為隨著提取液的增加，響鈴草與提取溶劑的接觸面增大，利于總黃酮的提取，當料液比超過1∶35（g/mL）時總黃酮含量略有下降，這可能是因為閃式提取器主要依靠機械剪切力和攪拌力使藥材有效成分溶解于溶劑中，溶劑過多這兩種力受阻，總黃酮的含量會有所下降，故選擇料液比為 1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40（g/mL）作為響應面設計的因素。

圖1 提取時間、乙醇提取分數(shù)、料液比對總黃酮含量的影響Fig.1 Effect of extraction time，ethanol concentration，solid-liquid ratio on total flavonoids content

2.3 響應面優(yōu)化設計的結果

試驗設計的結果如表2。

表2 試驗設計及結果Table 2 Design and results of tests

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行設計和擬合后，得多元回歸方程為Y=21.56+0.15A+0.27B+0.26C+0.057AB+0.050AC-0.038BC-0.98A2-1.26B2-1.58C2。對響鈴草總黃酮含量進行方差分析、方程的顯著性檢驗、系數(shù)顯著性檢驗，結果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

續(xù)表3 方差分析Continue table 3 Analysis of variance

該模型方程有顯著意義（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.087 2＞0.05），說明該回歸模型可以充分反應出響鈴草總黃酮的提取效果，并作出良好預測。判定系數(shù)R2=0.991 2說明模型擬合度好，相關性好，R2adj=0.979 9說明回歸模型能較好地反應出因素和因變量的關系，可信度高，可用于響鈴草總黃酮最優(yōu)提取工藝參數(shù)的推測和分析。一次項B（乙醇體積分數(shù)）、C（料液比）對總黃酮的提取效果影響極顯著（P＜0.01），各因素影響程度依次為B（乙醇體積分數(shù)）＞C（料液比）＞A（提取時間）；交互項AB，AC，BC對總黃酮的提取效果不顯著（P＞0.05）；二次項 A2，B2，C2對總黃酮的提取效果影響極顯著（P＜0.01），響應面的分析如圖2。

2.4 驗證試驗結果

圖2 各因素響應面圖Fig.2 Response surface plots for various factors

通過Design-Expert 8.0.6軟件設計出的方案進行試驗，最后得出最優(yōu)提取工藝條件為提取時間92.45 s，乙醇濃度61.10%，料液比1∶35.40（g/mL），預測總黃酮含量為21.591 5 mg/g，根據(jù)實際情況，將提取工藝定為提取時間92s，乙醇濃度60%，料液比 1∶35（g/mL）。進一步進行試驗驗證后，測得總黃酮含量為21.414 2 mg/g，與預測值比較接近，表明該模型準確可靠，能對試驗進行準確預測，因此將此提取工藝作為響鈴草總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)。

2.5 體外抗氧化性試驗結果

體外抗氧化性結果如圖3。

圖3 體外抗氧化性結果Fig.3 Results of in vitro antioxidant activity determination

由圖3可知，響鈴草提取物對DPPH自由基、羥自由基的清除率以及還原力隨著總黃酮濃度的增加而增強，但其作用效果均低于VC。

3 結論

由于響鈴草是全草入藥，葉綠素較多，提取過后需要用極性小的溶劑如石油醚將其萃取出，以免影響總黃酮吸光度的測定。響應面法能優(yōu)化提取工藝參數(shù)，對試驗結果預測性好，可將影響總黃酮提取效果的各因素與總黃酮的含量進行擬合和線性回歸，并預測最優(yōu)提取條件，方法穩(wěn)定可靠。本試驗在單因素試驗下，選擇影響總黃酮提取效果較大的因素和水平，采用Box-Behnken響應面法對響鈴草總黃酮的提取工藝進行設計和優(yōu)化，最優(yōu)條件為提取時間92 s，乙醇濃度60%，料液比為1∶35（g/mL），總黃酮含量為21.414 2 mg/g與預測值接近，說明該方法可靠且預測性好。將最優(yōu)提取條件下的總黃酮提取液進行體外抗氧化性試驗，發(fā)現(xiàn)其具有較強的清除DPPH自由基、羥自由的能力，還原力也較高。響鈴草為西南地區(qū)常用的民族藥材，本試驗可為響鈴草進一步的開發(fā)利用提供一定依據(jù)。