硫酸酯化沙棘葉多糖的制備及其解酒作用

湯威威，張宇，王宇亮，王麗紅，王瑞瑤，王偉鏵，張凱，趙宏，2，*

（1.佳木斯大學藥學院，黑龍江佳木斯154007；2.黑龍江中醫(yī)藥大學中藥學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040）

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）是胡頹子科沙棘屬的落葉灌木或小喬木，《中國藥典》中記載沙棘具有健脾消食，止咳祛痰，活血散瘀的功效[1]。目前沙棘的應用主要集中在果實，其葉尚未得到有效開發(fā)和利用，通過前期對沙棘葉進行初步總結和研究發(fā)現(xiàn)，其葉含有豐富的黃酮、多糖等化合物，黃酮類化合物具有抗菌、保肝及調(diào)節(jié)血脂等作用[2-4]，多糖具有抗菌、抗氧化、抗突變等作用[5-7]。

中藥多糖具有良好的抗氧化[8]、解酒[9]、保肝[10]等活性，且活性大小取決于其分子結構和其他物理化學性質(zhì)，包括水溶性，羥基的取代類型和程度等[11]。因此，對多糖進行適當修飾能夠改善其分子結構和理化性質(zhì)，從而增強其原有活性或增加新活性。目前中藥多糖的修飾方法主要集中在硫酸酯化[12]、磷酸酯化[13]及硝酸酯化[14]等修飾方法，其中硫酸酯化是目前最重要的中藥多糖修飾手段。

急性酒精中毒（俗稱醉酒）是指患者大量飲酒后發(fā)生的機體損傷的過程[15]。目前臨床上用于防治急性酒精中毒的藥物，其主要成分為興奮劑、氨基酸、維生素等，無實際解酒效果或解酒效果不佳。通過前期試驗已經(jīng)證實沙棘葉多糖對急性酒精中毒小鼠具有一定的解酒作用，且對乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）具有一定的激活作用。本研究擬建立可食用酒精對小鼠致急性酒精中毒模型，探究硫酸酯化沙棘葉多糖解酒作用，為沙棘葉的有效利用及沙棘葉產(chǎn)品保健價值的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

清潔級KM小鼠6周齡，體重18 g～22 g，90只，購自哈爾濱醫(yī)科大學，實驗單位使用許可證編號：SYXK（黑）2013-001，飼養(yǎng)于SPF級動物室。

沙棘葉購于佳木斯民生藥行，批號170719，經(jīng)佳木斯大學藥學院張宇教授鑒定為胡頹子科植物沙棘的干燥葉，符合2015年版《中國藥典》規(guī)定，現(xiàn)樣品保存于佳木斯大學藥學院（編號171604）。

氯磺酸、吡啶、無水N，N-二甲基甲酰胺：上海阿拉丁試劑有限公司；紅星牌56度二鍋頭白酒：北京紅星股份有限公司產(chǎn)品；海王金樽：深圳海王藥業(yè)公司產(chǎn)品；乙醇脫氫酶試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA-2004型電子天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；DF-101S型恒溫磁力攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)公司；FDU-1200型冷凍干燥機、WFO-420W定溫干燥箱：日本東京理化株式會社；DL-5-B型高速離心機：上海安亭科學儀器廠；765紫外可見分光光度計：上海光譜儀器廠；FTIR-8400S型紅外光譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 沙棘葉多糖的制備

沙棘葉粉碎、干燥后，采用石油醚回流脫脂，陰干。取干燥沙棘葉，蒸餾水提取，減壓濃縮，加入無水乙醇至上清液濃度為80%，冷藏靜置24 h，離心得沉淀，采用活性炭脫色，冷凍干燥即得沙棘葉多糖（seabuckthorn leaf polysaccharide，SLP）。

1.3.2 硫酸酯化沙棘葉多糖（sulfated seabuckthorn leaf polysaccharide，SSLP）的制備

1.3.2.1 SLP硫酸酯化

在附有磁力攪拌裝置的干燥三頸瓶中，加入10 mL無水吡啶，置于冰浴中冷卻至0℃后，攪拌下緩慢加入3 mL氯磺酸，約1 h滴完，得到淡黃色固體酯化試劑，-20℃冷凍備用[16]。

精密稱取SLP 200 mg于20 mL無水N，N-二甲基甲酰胺中，溶解后加入上述酯化試劑中，60℃反應3 h，反應結束冷卻至室溫（25℃），20%的NaOH調(diào)節(jié)pH值至中性，加入無水乙醇至上清液濃度為80%，冷藏靜置24 h，離心收集沉淀，雙蒸水透析72 h，冷凍干燥得SSLP。

1.3.2.2 氯化鋇-明膠濁度法測定SSLP取代度

分別移取 1 mg/mL 硫酸鈉溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL放入潔凈試管中，用1 mol/L鹽酸補至2 mL，各試管分別加入3.8 mL 3%三氯乙酸和1 mL氯化鋇-明膠溶液（氯化鋇1%，明膠0.5%），靜置20 min。在360 nm下測定反應吸光度值A，繪制硫酸基標準曲線[17]。

精密稱取SSLP5mg于10mL容量瓶中，加入1mol/L HCl溶液水解，取水解液2 mL按上述步驟操作測定吸光度，計算硫酸基含量。

式中：S為待測樣品硫酸基的含量，%；WS為糖解液吸光度對應下的硫酸基質(zhì)量，mg；W為所取多糖的質(zhì)量，mg；DS為待測樣品硫酸基取代度。

1.3.2.3 紅外光譜分析

稱取SLP和SSLP各1 mg分別與KBr混合研磨、壓片，以KBr為掃描背景，在4 000 cm-1～500 cm-1范圍內(nèi)掃描檢測[18]。

1.3.3 SSLP的解酒作用

1.3.3.1 SSLP和SLP對ADH活性的影響

選取濃度為 0.1、0.5、1.0 mg/mL的 SSLP溶液，采用瓦勒-霍赫（Valle&Hoch）法并稍加改良后檢測乙醇脫氫酶活性，各試劑混合后在25℃下，溫育5 min。溫育后立即加入乙醇脫氫酶0.1 mL，搖勻后用分光光度計測定在340 nm處的吸光度值，以后每隔30 s讀數(shù)1次，連續(xù)測定5 min，記錄數(shù)據(jù)[19]。

根據(jù)生成的還原型輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）在340 nm時摩爾消光系數(shù)為6.2，計算ADH的活性，ADH的活性以每分鐘生成NADH的納摩爾數(shù)（nmol/min）表示，按公式（3）計算 ADH 活性，并按公式（4）計算激活率：

式中：ΔA340nm為平均每分鐘的吸光度變化值；6.2為NADH在340 nm處的摩爾消光系數(shù)。

1.3.3.2 SSLP對急性酒精中毒小鼠影響

選取健康雄性昆明種小鼠90只，隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組（0.607 g/kg）、SSLP 高（1.214 g/kg）、中（0.607 g/kg）、低（0.303 g/kg）劑量組、SLP 高（1.214 g/kg）、中（0.607 g/kg）、低（0.303 g/kg）劑量組，每組10只，適應性喂養(yǎng)7 d。對SLP及SSLP各組小鼠分別灌胃給予相應藥物，空白組及模型組給予等體積的蒸餾水，1次/d，連續(xù)14 d，每周稱重2次。第14天各組灌胃完成后禁食不禁水12 h，于第15天對SLP及SSLP各組小鼠按照上述劑量進行灌胃，模型組和空白組灌胃等體積蒸餾水。30 min后，各組分別灌胃給予紅星二鍋頭14 mL/kg，空白組給予同體積的蒸餾水[20]。

以小鼠的翻正反射消失為標準，判斷小鼠是否處于急性酒精中毒狀態(tài)，記錄小鼠醉酒潛伏時間（即從灌酒到翻正反射消失的時間）及持續(xù)醉酒時間（即從翻正反射消失到清醒的時間）[21]。

每組小鼠在灌酒后1 h取血，3 500 r/min，低溫離心10 min，分離血清，-20℃冰箱保存，測定并計算血液中ADH的活性，檢測步驟嚴格按照試劑盒說明方法進行。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，實驗數(shù)據(jù)結果以平均值±標準差（±S）來表示，組間差異比較采用配對樣品T檢驗，用P＜0.05表示差異顯著，判斷組間是否存在著差異性。

2 結果與分析

2.1 硫酸酯化多糖試驗結果

2.1.1 SLP及SSLP性狀

SLP提取率為5.5%，且SLP呈現(xiàn)淡黃色粉末（左圖），SSLP較SLP顏色深，呈棕褐色絮狀粉末（右圖），結果見圖1。

圖1 SLP與SSLP實物圖Fig.1 The picture of SLP and SSLP

2.1.2 SSLP硫酸基取代度

硫酸基標準曲線回歸方程為y=0.590 7x+0.177 3，R2=0.990 6，結果見圖 2。

根據(jù)公式（1）和（2）得SSLP硫酸基含量為15.90%，取代度為1.63。

2.1.3 紅外光譜分析

沙棘葉多糖（SLP）在3 435.17 cm-1處的寬峰為OH鍵的伸縮振動峰；2 918.18 cm-1處的峰為C-H鍵的伸縮振動峰，這些區(qū)域的吸收峰為糖類的特征吸收峰。硫酸酯化沙棘葉多糖（SSLP）3 440.96 cm-1處的寬峰為多糖中-OH的伸縮振動峰；2 933.69 cm-1處的峰為C-H鍵的伸縮振動峰；在1 244.07 cm-1處有一明顯的吸收峰該峰為的S=O伸縮振動吸收峰；808.16 cm-1處為C-O-S的伸縮振動峰，表明硫酸基被轉(zhuǎn)移到沙棘葉多糖上，形成了新的化學鍵。SSLP與SLP主體特征吸收波形、吸收峰等特征指標基本相同，表明氯磺酸-吡啶法未破壞多糖的糖環(huán)結構，結果見圖3。

圖2 硫酸基含量測定標準曲線Fig.2 Calibration curve for the determination of sulfate conten

圖3 SLP與SSLP紅外圖譜Fig.3 The infrared spectrum（IR）spectra of SLP and SSLP

2.2 SSLP的解酒作用

2.2.1 SSLP和SLP對ADH活性影響

各濃度的SSLP及SLP溶液對ADH均具有激活作用，隨著濃度的增加而增加，且同濃度的SSLP溶液激活作用優(yōu)于SLP，結果見圖4。

圖4 SSLP和SLP對ADH活性的影響Fig.4 The effect of SSLP and SLP on ADH acticity

2.2.2 SSLP對急性酒精中毒小鼠的解酒作用

小鼠急性酒精中毒模型建立過程中，空白組小鼠未出現(xiàn)翻正反射消失的情況，模型組小鼠出現(xiàn)翻正反射消失的情況，表明小鼠急性酒精中毒模型建立成功。

與模型組比較，陽性藥物組、SLP高劑量組、SSLP中劑量組小鼠醉酒潛伏期顯著延長（P＜0.05），SSLP高劑量組小鼠醉酒潛伏期極顯著延長（P＜0.01）；與陽性藥物組比較，SSLP高劑量組小鼠醉酒潛伏期顯著延長（P＜0.05）。與模型組比較，陽性藥物組、SLP高劑量組和SSLP中劑量組持續(xù)醉酒時間極顯著縮短（P＜0.05），SSLP高劑量組持續(xù)醉酒時間極顯著縮短（P＜0.01）；與陽性藥物組比較，SSLP高劑量組小鼠醉酒潛伏期顯著縮短（P＜0.05）。說明SLP與SSLP均具有良好的解酒效果，SSLP的解酒作用優(yōu)于SLP，結果見表1。

表1 SSLP對急性酒精中毒小鼠的影響（±S，n=10）Table 1 The effect of the SSLP of acute alcoholism mice（±S，n=10）

表1 SSLP對急性酒精中毒小鼠的影響（±S，n=10）Table 1 The effect of the SSLP of acute alcoholism mice（±S，n=10）

注：與模型組比較，a表示在0.05水平顯著差異，b表示在0.01水平顯著差異；與陽性藥物組比較，c表示在0.05水平顯著差異，d表示在0.01水平顯著差異。

ADH活性/（U/mL）空白組 0 0 27.35±14.96模型組 20.70±4.62 369.38±48.63 17.60±9.38陽性藥物組 0.607 24.30±5.01a 332.50±36.69a 24.03±6.76a SSLP 組 0.303 23.80±4.77 346.63±57.49 21.75±6.98a 0.607 26.30±6.57a 298.50±24.97a 25.20±4.98bc 1.214 27.12±7.56bc 280.00±41.23bc26.49±5.32bd SLP 組 0.303 22.58±3.64 354.70±28.62 20.61±5.62 0.607 24.19±5.14 324.19±31.20 23.15±4.58a 1.214 26.45±4.28a 300.49±42.11a 25.42±6.12a組別 劑量/（g/kg）醉酒潛伏時間/min持續(xù)醉酒時間/min

2.2.3 SSLP對急性酒精中毒小鼠體內(nèi)乙醇脫氫酶活性影響

與模型組比較，陽性藥物組、SLP高劑量組、SSLP低劑量和中劑量組小鼠ADH活性顯著增強（P＜0.05），SSLP高劑量組小鼠ADH活性極顯著增強（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，SSLP中劑量組小鼠ADH活性顯著增強（P＜0.05），SSLP高劑量組小鼠ADH活性極顯著增強（P＜0.01）。說明SLP與SSLP對ADH均具有激活作用，SSLP的激活作用優(yōu)于SLP。結果見表1。

3 結論與討論

人體攝入酒精后，經(jīng)胃腸道吸收，少量直接通過肺、尿液和汗液排出體外，90%以上通過肝臟代謝[22]。當肝臟內(nèi)代謝過程中，乙醇經(jīng)乙醇脫氫酶（ADH）氧化為乙醛，乙醛通過乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）氧化為乙酸，乙酸經(jīng)三羧酸循環(huán)，徹底氧化為水和二氧化碳排出體外[23]。機體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶的催化下大量脫氫氧化，同時乙醇能激活氧分子，產(chǎn)生大量氧自由基，使機體清除自由基的能力減弱。因此，解酒藥物主要通過提高ADH活性加速乙醇的氧化代謝、清除酒精代謝產(chǎn)生的自由基等方面進行解酒[24]。

本文結果表明，SLP和SSLP均能夠提高ADH活性，同劑量下SSLP對ADH的激活作用優(yōu)于SLP，推斷其原因是多糖經(jīng)硫酸酯化修飾后，硫酸基和糖環(huán)上的羥基形成氫鍵，陰離子間的相互排斥作用使糖苷鏈鏈段適當伸長，形成螺旋結構，降低多糖黏度，從而使其對ADH的激活作用增強，加速乙醇氧化代謝。SLP高劑量組和SSLP中、高劑量組均能夠顯著延長急性酒精中毒小鼠醉酒潛伏時間，縮短持續(xù)醉酒時間，提高ADH 活性（P＜0.05，P＜0.01）。但相同劑量下 SSLP 對急性酒精中毒小鼠的解酒作用優(yōu)于SLP。有研究表明，硫酸基等吸電子基團，能夠影響O-H鍵的解離能力，硫酸基存在糖鏈上越多，O-H鍵的解離能力就越弱，對超氧陰離子等自由基的清除作用就越強[25]。因此推斷，SSLP較SLP具有更強的清除酒精代謝產(chǎn)生自由基的能力。

綜上所述，SSLP與SLP能夠顯著提高ADH活性，加速乙醇氧化代謝，清除酒精代謝產(chǎn)生的自由基，保護肝細胞免受酒精代謝毒物和自由基的損害，從而起到解酒作用，其中SSLP活性更優(yōu)，可以作為解酒的中藥物質(zhì)基礎開展深入研究，為開發(fā)高效、低毒且具有解酒、護肝功效的天然植物類保健品和藥物奠定基礎。