基于螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)凋亡的系統(tǒng)構(gòu)建及鑒定

車路平，栗永華，楊斌，徐智凱，廖瑛，仇旭升，譚磊，孫英杰，宋翠萍，丁鏟，姚剛，王金泉，孟春春

基于螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)凋亡的系統(tǒng)構(gòu)建及鑒定

車路平1, 2，栗永華1, 2，楊斌1, 2，徐智凱1, 2，廖瑛2，仇旭升2，譚磊2，孫英杰2，宋翠萍2，丁鏟2，姚剛1，王金泉1，孟春春2

1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所，上海 200241

為構(gòu)建一個(gè)能夠快速檢測(cè)凋亡的含熒光素酶報(bào)告基因 (Fluc) 的真核表達(dá)質(zhì)粒，采用PCR的方法將Caspase-3的識(shí)別基序Asp-Glu-Val-Asp (DEVD) 四個(gè)氨基酸引入至Fluc基因的C端和N端之間；同時(shí)選取Asp-Glu-Val-Gly (DEVG) 四個(gè)氨基酸作為陰性對(duì)照。隨后重組片段分別克隆至分離型內(nèi)含肽的N端和C端之間，并命名為pFluc-DEVD和pFluc-DEVG。將該表達(dá)質(zhì)粒與海腎熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒 (RLUC) 同時(shí)轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因和Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)發(fā)生凋亡時(shí)，pFluc-DEVD質(zhì)粒組表達(dá)的螢火蟲(chóng)熒光素酶的含量高出pFluc-DEVG質(zhì)粒組約3倍。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pFluc-DEVD質(zhì)粒的細(xì)胞在凋亡藥物刺激后，F(xiàn)luc活化的蛋白顯著增多，且Caspase-3 的活化程度與Fluc的表達(dá)呈正相關(guān)，并有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明，pFluc-DEVD真核表達(dá)質(zhì)粒表達(dá)的螢火蟲(chóng)熒光素酶蛋白能被細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3酶裂解，且該質(zhì)粒能夠精確地反映出細(xì)胞的凋亡水平，為后續(xù)進(jìn)行凋亡定量檢測(cè)提供了一個(gè)可借鑒的方法。

螢火蟲(chóng)熒光素酶，凋亡，Caspase-3

細(xì)胞凋亡，又稱細(xì)胞程序性死亡 (Programmed cell death，PCD)，由病理學(xué)家Kerr于1972年提出，是指細(xì)胞為了更好地適應(yīng)生存環(huán)境而采取的主動(dòng)死亡過(guò)程[1]。細(xì)胞凋亡受基因調(diào)控，貫穿于生物體生命活動(dòng)的全部過(guò)程，它不僅在胚胎和大腦的發(fā)育及機(jī)體免疫等過(guò)程中扮演重要角色，而且在心血管疾病、神經(jīng)性病變及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到至關(guān)重要的作用[4]。比如，當(dāng)?shù)蛲鍪艿揭种?，?huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和病毒感染，而不適當(dāng)?shù)募?xì)胞凋亡激活，是中風(fēng)、心肌梗死、早老性癡呆、帕金森病、艾滋病、造血系統(tǒng)疾病等發(fā)生的重要原因。

研究表明，Caspase家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)與執(zhí)行過(guò)程中的作用至關(guān)重要[2–3]。因此建立一個(gè)快速檢測(cè)Caspase蛋白酶活性的方法，有利于盡早判斷細(xì)胞的凋亡狀態(tài)，且可以為篩選干預(yù)細(xì)胞凋亡狀態(tài)來(lái)治療疾病的藥物提供方便快捷的途徑。

細(xì)胞凋亡主要分為：內(nèi)源性凋亡途徑 (Intrinsic pathway)，主要由諸多應(yīng)激條件、化學(xué)治療試劑和藥物所導(dǎo)致；外源性凋亡途徑 (Extrinsic pathway)，由死亡受體如TNF、FasL等介導(dǎo)[1]。其中Caspase-3蛋白是內(nèi)源性凋亡途徑與外源性凋亡途徑的匯集點(diǎn)，且在凋亡早期被激活，晚期細(xì)胞和死亡細(xì)胞中Caspase-3的活性下降，因此Caspase-3可被作為細(xì)胞凋亡的早期判斷指標(biāo)之一[4]。而通過(guò)定量檢測(cè)Caspase-3活性，從而監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡的水平，最終為篩選適宜的抗腫瘤藥物提供最佳途徑。為建立一種快速高效檢測(cè)鑒定細(xì)胞凋亡的方法，之前已有研究者將Caspase-3作用的底物與熒光共振能量轉(zhuǎn)移肽對(duì)[5]或D-熒光素[6]進(jìn)行連接用以檢測(cè)Caspase-3的活性，但是這種檢測(cè)方法的靈敏度較差且實(shí)驗(yàn)過(guò)程較為繁瑣。本研究選用螢火蟲(chóng)熒光素酶作為報(bào)告基因用以構(gòu)建含有Caspase-3識(shí)別基序的真核表達(dá)質(zhì)粒，當(dāng)?shù)蛲霈F(xiàn)象發(fā)生，Caspase-3激活后將質(zhì)粒中的DEVD剪切出來(lái)，之后螢火蟲(chóng)熒光素酶基因 (Fluc) 的N端和C端相互靠近激活發(fā)出熒光，最后通過(guò)檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的表達(dá)情況進(jìn)而判定細(xì)胞的凋亡情況。該方法可在96孔板中進(jìn)行，靈敏度高、操作簡(jiǎn)便且省時(shí)高效，有望成為篩選抗腫瘤藥物的新方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、載體及主要試劑

真核表達(dá)載體pCI-neo、HeLa及A549細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶RⅠ、Ⅰ以及Ⅰ，In-Fusion HD Cloning Plus (638909) 購(gòu)自TaKaRa公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Fugene、Dual-Luciferase Reporter Assay System 購(gòu)自普洛麥格 (Promega) 公司；大腸桿菌DH5α、DNA 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小提中量試劑盒及無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自天根生化科技 (北京) 有限公司；Phanta EVO Super-Fidelity DNA Polymerase 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自西格瑪奧德里奇 (Sigma) 公司；Anti-Luciferase mAb (貨號(hào)M095-3) 購(gòu)自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；Caspase-3 (貨號(hào)9665，單抗) 和PARP (貨號(hào)9542，多抗) 購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；二抗鼠抗 (貨號(hào)115-035-003) 和兔抗 (貨號(hào)111-035-003) 購(gòu)自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成

應(yīng)用Primer Premier 5.0基因分析軟件，根據(jù)GenBank上公布的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因 (Firefly luciferase gene) 序列 (GenBank登錄號(hào)：DS235862.1) 設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(圖1)，第一對(duì)引物的上游引物Fluc-NF-VD，下游引物Fluc-NR (表1)，擴(kuò)增螢火蟲(chóng)熒光素酶基因N端 (2–416 aa)，并在上游引物的5′端引入4個(gè)氨基酸DEVD (Caspase-3識(shí)別基序)，在下游引物的5′端引入Ⅰ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)物大小為1 279 bp，由于第一對(duì)引物擴(kuò)增的是螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的N端，且在上游引物的5′端引入了DEVD序列，因而將其分別命名為Fluc-NF-VD及Fluc-NR。第二對(duì)引物的上游引物Fluc-CF，下游引物Fluc-CR-VD (表1)。用以擴(kuò)增螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的C端 (399–550 aa)，并在上游引物的5′端引入Ⅰ酶切位點(diǎn)，在下游引物的5′端引入4個(gè)氨基酸DEVD，產(chǎn)物大小為 487 bp，由于第二對(duì)引物擴(kuò)增的是螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的C端，且在下游引物的5′端引入了DEVD序列，因而將其分別命名為Fluc-CF及Fluc-CR-VD。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；16 ℃結(jié)束反應(yīng)。以擴(kuò)增出來(lái)的螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的N端及C端基因?yàn)槟０澹現(xiàn)luc-CF、Fluc-NR為引物利用融合PCR的方法擴(kuò)增完整的帶有DEVD的Fluc，產(chǎn)物大小為 1 766 bp。同理擴(kuò)增帶有DEVG (只與DEVD有1個(gè)氨基酸不同，作為陰性對(duì)照) 的Fluc片段。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，64 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min；16 ℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.2 DnaEC-DnaEN-PEST片段的合成

由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成帶有DnaEC-DnaEN-PEST片段的pUC質(zhì)粒，并在片段兩端預(yù)留RⅠ、Ⅰ酶切位點(diǎn)，DnaEC與DnaEN之間預(yù)留Ⅰ酶切位點(diǎn)。DnaEN及DnaEC分別為分裂型內(nèi)含肽的N端及C端，其功能是使外源表達(dá)的Fluc的N端與C端重新連接形成成熟蛋白。PEST為一段富含脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的多肽，它的作用是水解剪接不完全的螢火蟲(chóng)熒光素酶蛋白。

圖1 引物設(shè)計(jì)模式圖

表1 擴(kuò)增Fluc片段所需引物

Annotation: Single undersore, Amino acid DEVD; Waveline, Amino acid DEVG; Double underscore,Ⅰ restriction site; Fluc, Firefly luciferase gene.

1.2.3 真核表達(dá)質(zhì)粒pFluc-DEVD及pFluc-DEVG的構(gòu)建

分別用限制性核酸內(nèi)切酶RⅠ、Ⅰ酶切帶有DnaEC-DnaEN-PEST片段的pUC質(zhì)粒以及空載pCI-neo質(zhì)粒，將DnaEC-DnaEN-PEST片段與pCI-neo進(jìn)行連接，PCR篩選獲得陽(yáng)性菌液并提取質(zhì)粒。用限制性核酸內(nèi)切酶Ⅰ酶切帶有DnaEC-DnaEN-PEST片段的pCI-neo重組陽(yáng)性質(zhì)粒，再采用In-Fusion HD Cloning Plus的方法將其與Fluc-DEVD或Fluc-DEVG片段進(jìn)行融合，構(gòu)建質(zhì)粒pFluc-DEVD及pFluc-DEVG。鑒定結(jié)果為陽(yáng)性者提取質(zhì)粒，并送生工生物工程 (上海) 股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確后，按照無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒備用。

1.2.4 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HeLa及A549細(xì)胞

將HeLa及A549細(xì)胞分為pFluc-DEVD質(zhì)粒組 (第一組) 和pFluc-DEVG組 (第二組)，將細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，37 ℃溫箱中培養(yǎng)12至18 h。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%–80%時(shí)，棄掉培養(yǎng)基，PBS清洗2遍后，每孔補(bǔ)加900 μL的Opti-MEM。按照普洛麥格公司Fugene試劑的使用說(shuō)明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后棄掉轉(zhuǎn)染混合物，加入1 mL含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)Fluc、Caspase-3及PARP的表達(dá)

脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后，棄掉培養(yǎng)液。PBS洗滌2次，使用200 μL 1×loading buffer裂解細(xì)胞收取樣品，100 ℃金屬浴10 min。10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，10%脫脂乳封閉1 h，以1∶1 000稀釋Fluc一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。TBST 洗滌3次，每次5 min，之后用1∶8 000稀釋的二抗于37 ℃孵育1 h。最后再用TBST洗滌3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)并拍照記錄。

1.2.6 螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶活性檢測(cè)

陽(yáng)性質(zhì)粒pFluc-DEVD、陰性質(zhì)粒pFluc- DEVG分別與Rluc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa及A549細(xì)胞48 h，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌2次后，按照雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，收集6孔板中的細(xì)胞裂解液。隨后用GloMax發(fā)光儀檢測(cè)Fluc和Rluc的活性，即每20 μL裂解液的上清加入100 μL的LARⅡ，檢測(cè)Fluc的活性。之后每孔加入100 μL Stop Buffer檢測(cè)Rluc的活性，記錄兩次分別測(cè)得的數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建模式圖

設(shè)計(jì)的凋亡檢測(cè)質(zhì)粒主要包括DnaE-C端、切割開(kāi)的Fluc-C、DEVD片段、Fluc-N、DnaE-N端、PEST序列，具體如圖2所示。

圖2 凋亡檢測(cè)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖

2.2 Fluc基因的融合

將Fluc的N端及C端進(jìn)行融合PCR，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果顯示在1 700 bp大小的位置有清晰的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致 (圖3)。

2.3 pFluc-DEVD及pFluc-DEVG質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

使用限制性核酸內(nèi)切酶RⅠ、Ⅰ酶切帶有的pUC質(zhì)粒以及空載pCI-neo質(zhì)粒，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收小片段即DnaEC- DnaEN-PEST片段，并將其與pCI-neo載體連接，構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR鑒定，條帶大小正確。

使用限制性內(nèi)切酶Ⅰ酶切構(gòu)建好帶有DnaEC-DnaEN-PEST片段的pCI-neo質(zhì)粒，并使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收，與擴(kuò)增好的Fluc-DEVD或Fluc-DEVG片段進(jìn)行重組。挑選重組質(zhì)粒的菌液進(jìn)行菌液PCR鑒定及質(zhì)粒的酶切鑒定。由圖4可知，構(gòu)建的pFluc-DEVD及pFluc- DEVG質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR擴(kuò)增得到大小為2 301 bp的目的片段，經(jīng)RⅠ、Ⅰ雙酶切鑒定可獲得大小為2 301 bp的目的條帶，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期一致。

圖3 Fluc全長(zhǎng)基因融合PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 Western blotting檢測(cè)Fluc的表達(dá)

在HeLa細(xì)胞中轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒pFluc- DEVG、陽(yáng)性質(zhì)粒pFluc-DEVD以及空載質(zhì)粒pCI-neo，48 h后加入促凋亡試劑STS作用2 h，收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。由圖5可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染pFluc-DEVD組能夠產(chǎn)生活化的Fluc蛋白，條帶大約為61 kDa，與預(yù)期結(jié)果一致。而 pFluc-DEVG組分裂的N端及C端Fluc蛋白相互靠近時(shí)能形成少量活化的Fluc蛋白，但總體上明顯少于pFluc-DEVD組，空白組及轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組均沒(méi)有條帶產(chǎn)生。

圖4 pFluc-DEVD及pFluc-DEVG質(zhì)粒的雙酶切鑒定

圖5 Western blotting檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)

2.5 Western blotting檢測(cè)Caspase-3和PARP的表達(dá)

將pFluc-DEVD或pFluc-DEVG質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞48 h，加入STS促凋亡試劑作用2 h后，收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行Western blotting檢測(cè)。由圖6可知，只加入pFluc-DEVG質(zhì)粒或pFluc-DEVD質(zhì)粒，并不能引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，排除了質(zhì)粒及轉(zhuǎn)染試劑的干擾。而加入1∶1 000稀釋的STS試劑后，pFluc-DEVD質(zhì)粒組及pFluc-DEVG質(zhì)粒組均產(chǎn)生PARP的裂解及Caspase-3的活化現(xiàn)象，與預(yù)期結(jié)果一致。該結(jié)果表明，促凋亡試劑STS進(jìn)行1 000倍稀釋時(shí)能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，且不會(huì)受到轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的影響，因而該試劑可作為用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)劑。

2.6 螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶活性檢測(cè)

將pFluc-DEVD或pFluc-DEVG質(zhì)粒與Rluc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HeLa及A549細(xì)胞48 h后，STS 促凋亡試劑以1∶1 000稀釋加入培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱放置2 h，檢測(cè)Rluc和Fluc的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，pFluc-DEVD質(zhì)粒的RLU值 (即relative light unit，RLU=LF/LR)是pFluc- DEVG質(zhì)粒的3倍 (圖7)，差異顯著；而未加凋亡刺激藥物的兩組質(zhì)粒的RLU值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

凋亡 (Apoptosis) 又被稱作細(xì)胞程序性死亡，是指為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡[1,7]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)凋亡在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色[8–10]。而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展及人們對(duì)于細(xì)胞凋亡的過(guò)程和分子機(jī)制的了解逐漸加深，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡的一系列實(shí)驗(yàn)方法也應(yīng)運(yùn)而生，例如鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化、細(xì)胞活力檢測(cè)、DNA片段檢測(cè)等[11–12]。但是這些方法大多數(shù)只能用于數(shù)量較少的樣本的檢測(cè)且操作過(guò)程繁瑣，做不到快速高效地進(jìn)行大批量樣本的檢測(cè)。目前已知有通過(guò)微流控芯片技術(shù)[13]以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)[14]進(jìn)行細(xì)胞凋亡的高通量檢測(cè)。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建Luciferase基底的質(zhì)粒 (生物傳感器)，將其轉(zhuǎn)染特定細(xì)胞系并結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn)方法，使得檢測(cè)可在96孔板中進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便且快速可行，有望成為新型高通量檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法。

圖6 Western blotting檢測(cè)Caspase-3和PARP的表達(dá)

研究表明[15]，Caspase-3能夠特異性識(shí)別DEVD-x，并水解D-x之間的肽段。針對(duì)這一特性，我們建立了pFluc-DEVD Luciferase和雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)的檢測(cè)方法。將Caspase-3 的酶切底物DEVD插入螢火蟲(chóng)熒光素酶基因 (Firefly luciferase，F(xiàn)luc) 的N端和C端之間，并將兩者進(jìn)行偶聯(lián)。為確保DEVD被切割之后，F(xiàn)luc基因能夠順利激活，在Fluc基因的N端和C端分別添加一段內(nèi)含肽 (Intein) 序列。內(nèi)含肽是一段宿主蛋白的氨基酸序列，與宿主蛋白基因存在于同一個(gè)開(kāi)放閱讀框內(nèi)，具有自我剪接的功能。本實(shí)驗(yàn)使用的是分離型內(nèi)含肽DnaE，來(lái)自于集胞藍(lán)細(xì)菌屬的DNA聚合酶Ⅲ的α亞單位，編碼的基因包括DnaE-N和DnaE-C[16]。有研究表明[17]，通過(guò)將分裂型內(nèi)含肽的N端與C端前后顛倒，可以用于外源表達(dá)蛋白的連接且內(nèi)含肽自身可以從成熟的蛋白中自我剪切出來(lái)。利用內(nèi)含肽這一特性，將DnaE的N端與C端前后顛倒后分別連接于Fluc-N端的末端及C端的開(kāi)端，從而使其利于Fluc的N端與C端外顯肽連接起來(lái)形成成熟蛋白。同時(shí)，為了提高內(nèi)含肽的蛋白剪接效率，在DnaE-C端與Fluc-C端之間插入CFNIS，以及在DnaE-N端與Fluc-N端之間插入了KFAEYC氨基酸序列。此外，質(zhì)粒中還插入了一段PEST序列。PEST是指一段富含脯氨酸 (P)、谷氨酸 (E)、絲氨酸 (S) 和蘇氨酸 (T) 的多肽，它的作用是使未剪接完全的螢火蟲(chóng)熒光素酶蛋白序列水解，從而減少未切割的Fluc蛋白帶來(lái)的干擾[18]。

當(dāng)細(xì)胞處于正常狀態(tài)時(shí)，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的Caspase-3處于非活性狀態(tài)，螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因的N端與C端蛋白被DEVD間隔開(kāi)，所以螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因不具備活性，因而無(wú)法發(fā)出熒光；而當(dāng)使用STS試劑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，內(nèi)含肽DnaE-C與DnaE-N相互連接形成完整的DnaE，之后DnaE將螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因N端和C端相連接，并將自身剪切下來(lái)，緊接著細(xì)胞內(nèi)活化的Caspase-3 能夠特異性剪切DEVD，最終使得螢火蟲(chóng)熒光素酶基因恢復(fù)活性，從而發(fā)出熒光 (圖8)。從Western blotting檢測(cè)Fluc的結(jié)果來(lái)看，pFluc-DEVD質(zhì)粒正常工作，能夠明顯檢測(cè)到激活后的線性Fluc蛋白 (下方條帶較粗的)，以及少量未激活的環(huán)狀Fluc蛋白 (上方顏色較淺的)。而轉(zhuǎn)染pFluc-DEVG質(zhì)粒組也檢測(cè)到少量的線性Fluc蛋白，后期可以通過(guò)對(duì)PEST序列進(jìn)行優(yōu)化以及插入其他序列，確保未活化的Fluc序列被徹底降解，從而將干擾降到最低。而后檢測(cè)PARP及Caspase-3蛋白，進(jìn)一步證實(shí)了在加入STS后，轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒后都發(fā)生了凋亡現(xiàn)象。之后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)來(lái)印證質(zhì)粒檢測(cè)凋亡的能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pFluc-DEVD質(zhì)粒的HeLa及A549細(xì)胞的RLU值比陰性對(duì)照 (轉(zhuǎn)染pFluc-DEVG質(zhì)粒) 要高出近3倍，再次表明Fluc基因成功激活，螢火蟲(chóng)熒光素酶能夠發(fā)出較高的熒光值。

綜上所述，本研究建立的pFluc-DEVD Luciferase和雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)細(xì)胞凋亡的方法，能夠準(zhǔn)確有效地檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活化從而了解細(xì)胞的凋亡情況，為將來(lái)進(jìn)行凋亡的高通量檢測(cè)，進(jìn)而篩選適宜的凋亡干預(yù)藥物提供了一個(gè)便利條件。

圖8 凋亡質(zhì)粒工作原理示意圖

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Construction and identification of an apoptosis detection system based on firefly luciferase reporter gene

Luping Che1,2, Yonghua Li1,2, Bin Yang1,2, Zhikai Xu1,2, Ying Liao2, Xusheng Qiu2, Lei Tan2, Yingjie Sun2, Cuiping Song2, Chan Ding2, Gang Yao1, Jinquan Wang1, and Chunchun Meng2

1 College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumgi 830052, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China 2 Shanghai Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 200241, China

To construct a eukaryotic expression plasmid containing the luciferase reporter gene (Fluc) to quickly detect apoptosis. Four amino acids, Asp-Glu-Val-Asp (DEVD), the recognize motif of Caspase-3, were introduced into the middle of the Fluc-C and N fragment. Meanwhile, four amino acids, Asp-Glu-Val-Gly (DEVG), were selected as a negative control. Subsequently, the recombinant gene was cloned into the N and C terminal end of the split intein, and named as pFluc-DEVD and pFluc-DEVG. Then the plasmids were transfected into cells and renilla luciferase was co-transfected in each sample as an internal control for transfection efficiency. Then the apoptosis level was detected by the double luciferase reporter gene and the Western blotting analysis. The results showed that when apoptosis occurred, the content of firefly luciferase expressed in the pFluc-DEVD plasmid transfected group was about 3 times higher than pFluc-DEVG plasmid transfected group. Furthermore, Western blotting detection indicated that the Fluc level was significantly increased in pFluc-DEVD transfected group when pre-treated by apoptosis stimulants. The activation degree of Caspase-3 was closely related to the expression of Fluc, and had a significant statistical difference. These results confirmed that firefly luciferase protein expressed by pFluc-DEVD plasmid can be cleaved by the intracellular Caspase-3 enzyme, and this plasmid can accurately reflect the cell apoptosis level, which provides a useful method for quantitative detection of apoptosis.

luciferase, apoptosis, Caspase-3

July 2, 2018;

September 17, 2018

Supported by: Open Project Fund of Shanghai Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No. KLAB201702), Waterfowl Viral Infectious Diseases Innovation Research Group Funding by Chinese Academy of Agricultural Sciences.

ChunchunMeng.Tel: +86-21-34293428; E-mail:mengcc@shvri.ac.cn

Jinquan Wang.Tel: +86-991-8763012; E-mail:wangjinquan4555@sina.com

上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(No. KLAB201702)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所水禽病毒病團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新工程經(jīng)費(fèi)資助。

車路平, 栗永華, 楊斌, 等. 基于螢火蟲(chóng)熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)凋亡的系統(tǒng)構(gòu)建及鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1557–1565.Che LP, Li YH, Yang B, et al. Construction and identification of an apoptosis detection system based on firefly luciferase reporter gene. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1557–1565.

(本文責(zé)編 郝麗芳)