基于超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對野蠶繭和家蠶繭化學(xué)成分進(jìn)行比較

張艷，董照明，趙東超，李浩云，王凌燕，林英，趙萍

基于超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對野蠶繭和家蠶繭化學(xué)成分進(jìn)行比較

張艷1,2，董照明2，趙東超2，李浩云2，王凌燕1,2，林英2，趙萍2

1 西南大學(xué) 生物技術(shù)學(xué)院，重慶 400715 2 西南大學(xué) 生物學(xué)研究中心，重慶 400715

鑒定并比較野蠶繭與家蠶繭的化學(xué)成分對于理解家蠶的馴化具有重要的意義。利用高溫高壓結(jié)合甲醇-水提取的方法獲得蠶繭中的化學(xué)成分，利用UHPLC-MS技術(shù)對野蠶、家蠶大造品種和皓月品種3種蠶繭絲中的小分子成分進(jìn)行鑒定和比較分析。通過陽離子模式和陰離子模式的UHPLC-MS獲得了野蠶、大造和皓月蠶繭絲的代謝指紋圖譜，對鑒定到的高豐度化合物進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)其中包括了氨基酸、黃酮、生物堿、萜類、有機(jī)酸和木脂素等成分。PLS-DA的得分圖表明，野蠶、家蠶大造品種和皓月品種的3種蠶繭的代謝組存在顯著差異。發(fā)現(xiàn)脯氨酸、亮氨酸/異亮氨酸和苯丙氨酸在大造繭中的含量顯著高于在野蠶和皓月繭中的含量，黃酮類植物次生代謝物在大造繭中的含量顯著提高，包括槲皮素、異槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山奈酚；而神經(jīng)堿、白橋樓堿、毛果蕓香次堿、美洲豚草內(nèi)酯、線葉澤蘭素和中緬木蓮素等生物堿、萜類和木脂素類的植物次生代謝物在野蠶繭中的含量顯著高于在家蠶繭中的含量。在紫外光的激發(fā)下觀察黃酮的綠色熒光發(fā)現(xiàn)家蠶大造繭中的黃酮含量最高，家蠶皓月繭中的黃酮含量最低，而野蠶繭中的黃酮含量居中。生物堿和有機(jī)酸是良好的抗蟲抗菌劑，它們在野蠶繭中的含量較高，能夠提高野蠶繭的防護(hù)能力。黃酮類物質(zhì)在家蠶大造繭中的含量較高，是導(dǎo)致家蠶大造繭呈黃綠色的主要原因。

家蠶，野蠶，蠶繭，液相色譜-質(zhì)譜，生物堿，黃酮

蠶絲主要是由絲素纖維以及包裹在絲素外層的絲膠所組成的。近年來的研究還從蠶絲中發(fā)現(xiàn)了酶、蛋白酶抑制劑和絲蕊 (Seroin) 等其他的蛋白質(zhì)組分[1-5]。蠶絲中除了蛋白成分外，還含有一些其他物質(zhì)，如糖類、蠟質(zhì)、色素和無機(jī)成分等[6]。筆者所在的課題組利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法從蠶繭絲中鑒定到了幾十種化合物[7]，發(fā)現(xiàn)它們對于保護(hù)蠶繭、提高蠶蛹的存活率有著重要作用。然而，由于氣相色譜-質(zhì)譜方法的局限性，導(dǎo)致所鑒定到的蠶繭化學(xué)成分并不全面，黃酮類等物質(zhì)在蠶繭中含量較多卻未被鑒定到。因此，利用其他方法全面解析蠶繭的小分子組分，比較分析野蠶繭和家蠶繭的化學(xué)成分差異，不僅有利于了解蠶繭中非蛋白組分的生物學(xué)功能，而且有利于深入理解馴化過程對于蠶絲組分的影響。

蠶絲的主要組分是絲素蛋白(Fibroin) 和絲膠絲蕊蛋白。絲素是纖維蛋白，位于蠶絲的核心，約占絲重的70%–80%。絲膠是膠狀的球蛋白，包裹著絲素，起著保護(hù)和膠黏的作用。除了絲素蛋白和絲膠外，蠶絲中還存在著蛋白酶抑制劑和絲蕊等抗微生物蛋白[1,3,8-9]；Guo等[1]發(fā)現(xiàn)蠶絲中的蛋白酶抑制劑不僅對真菌蛋白酶表現(xiàn)出高效的抑制活性，還能夠抑制白僵菌孢子的萌發(fā)。Singh等[9]發(fā)現(xiàn)蠶絲中的絲蕊具有抗細(xì)菌和抗病毒活性。蠶絲中除了蛋白成分外還含有一些小分子化學(xué)成分，它們的含量很少，大部分分布在絲膠中，它們的含量常因蠶的品種、產(chǎn)地、飼養(yǎng)條件、繭層層次而有所差別。Zhang等[7]利用GC-MS的方法從蠶繭絲中鑒定到了糖類、脂肪酸、氨基酸、有機(jī)酸和烴類等45種化合物，并且發(fā)現(xiàn)17種化合物在野蠶繭中的含量顯著高于在家蠶繭中的含量，它們可能對于提高野蠶在野外惡劣環(huán)境中的存活率有著重要作用。蠶繭中的檸檬酸有抗菌的活性，而糖類、脂肪酸和長鏈烴類(蠟質(zhì)) 有防水保水的作用。蠶絲的顏色主要受類胡蘿卜素和類黃酮色素的影響[10-17]。蠶絲中的類胡蘿卜素包括葉黃素、紫黃質(zhì)、β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素。不同繭色家蠶品種的絲腺偏向于積累某一種類的類胡蘿卜素，紅色繭中的β-胡蘿卜素積累量最高，金色繭中的葉黃素積累量最高[18]，而野蠶的黃色繭也是含有葉黃素的原因[19]。黃綠色繭絲中的主要色素是黃酮。Tamura等[21]從3種蠶繭中鑒定到了槲皮素-5,4?-di-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-5,7,4?- tri-O-β-D-葡萄糖苷[20]。黃酮可以提高蠶繭的抗紫外性能，從而增加蠶蛹的存活率。

近年來關(guān)于蠶絲蛋白組分的研究已經(jīng)取得了較多進(jìn)展，然而關(guān)于蠶絲中非蛋白組分的研究仍然較少。目前，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS) 和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS) 的技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于鑒定動植物中的化學(xué)成分。兩者具有不同的工作原理，適合于鑒定不同特性的化學(xué)成分。筆者之前的研究已經(jīng)利用GC-MS的方法對蠶繭絲中的化合物進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定[7]。為了更好地理解蠶繭絲中的非蛋白質(zhì)成分的種類與作用，有必要利用LC-MS的方法對蠶繭絲化學(xué)成分進(jìn)行全面的研究。

本研究利用UHPLC-MS方法對野蠶、家蠶大造品種和皓月品種3種蠶繭絲中的小分子成分進(jìn)行鑒定和比較分析，揭示蠶繭絲中小分子物質(zhì)的種類與作用，闡明馴化造成的野蠶繭和家蠶繭化學(xué)成分的差異及意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

家蠶大造品種和皓月品種由西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。野桑蠶采集自重慶市長壽區(qū)。家蠶和野蠶用桑葉進(jìn)行飼喂，實(shí)驗(yàn)材料為新鮮的蠶繭。甲醇、甲酸和乙腈購于Sigma公司。

1.2 蠶繭樣品的前處理

分別稱取野蠶、大造和皓月蠶繭0.01 g，置于2 mL離心管，每管加純化水200 μL，121 ℃ 高壓2 h。將每管上清吸出置于新的1.5 mL離心管中，沉淀用400 μL 80%甲醇洗脫，將洗脫液與上述1.5 mL離心管合并，再補(bǔ)加800 μL甲醇，使甲醇終濃度為80%，4 ℃靜置過夜。14 000×離心15 min后吸上清濃縮干燥。每管加200 μL 80%甲醇復(fù)溶。瓶口用封口膜封住防止揮發(fā)，渦旋1 min，超聲30 min，振蕩5 min。14 000×離心15 min，取180 μL上清置于質(zhì)譜上樣瓶中。

1.3 液質(zhì)聯(lián)用分析條件

液相分離條件：Thermo Ultimate 3000超高效液相色譜儀(UHPLC，Thermo scientific)，安捷倫- C18色譜柱(1.8 μm, 2.1 mm×100 mm)-陽離子模式下色譜柱；安捷倫-C18色譜柱(1.8 μm，2.1 mm× 100 mm)-陰離子模式下色譜柱。柱溫50 ℃，0.1% 甲酸-水A和0.1%甲酸-水的乙腈B梯度洗脫： 0–1 min 0%–2% B，1–9 min 2%–40% B，9–20 min 40%–75% B，20–27 min 75%–98% B，27–32 min 98% B平衡柱5 min，32–37 min沖洗并平衡柱系統(tǒng)。流速0.2 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)行UHPLC-MS分析，每種蠶繭樣品進(jìn)行8次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

質(zhì)譜檢測條件：Thermo Q-Exactive (Thermo scientific)，ESI+電離模式下，電噴霧電壓3 200 V，鞘氣(N2) 流速35 L/min，輔氣(N2) 流速5 L/min，傳輸管溫度350 ℃，S-lens為60；ESI-電離模式下，電噴霧電壓2 800 V，鞘氣(N2) 流速35 L/min，輔氣(N2) 流速5 L/min，傳輸管溫度320 ℃，S-lens 為60。質(zhì)譜掃描范圍150–2 000/。

1.4 液質(zhì)聯(lián)用數(shù)據(jù)處理與分析

代謝特征提取、濾噪及歸一化：運(yùn)行sieve程序進(jìn)行代謝特征提取和色譜匹配。將原始代謝指紋數(shù)據(jù)導(dǎo)入到sieve程序，進(jìn)行代謝特征提取，同樣采用80%規(guī)則對峰表進(jìn)行信號過濾，排除在多于20%實(shí)驗(yàn)組與對照組樣品中響應(yīng)值為“0”的代謝特征。之后將所有代謝特征的響應(yīng)值進(jìn)行面積歸一化，抑制分析過程中質(zhì)譜信號響應(yīng)的漂移。按照代謝特征質(zhì)譜響應(yīng)信號的強(qiáng)度值進(jìn)行缺失值補(bǔ)值。使用SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析(PCA) 和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)。

在R語言環(huán)境下運(yùn)行XCMS程序運(yùn)行代謝特征提取和色譜匹配。將原始代謝指紋數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為NetCDF數(shù)據(jù)格式后，導(dǎo)入到XCMS程序。使用XCMS默認(rèn)的xcmsSet算法進(jìn)行代謝特征提取，代謝特征再經(jīng)色譜匹配和缺失值補(bǔ)值。采用80%規(guī)則對峰表進(jìn)行信號過濾，即排除在多于20%實(shí)驗(yàn)組與對照組樣品中響應(yīng)值為“0”的代謝特征。歸一化主要是對樣品的操作，由于樣品間的化合物濃度差異較大或樣品采集過程中容易產(chǎn)生差異，為了緩解這種不均一性，一般使用化合物的相對峰面積響應(yīng)值，即每個化合物峰面積除以樣品的總峰面積乘一個常數(shù)，由此來校正個體差異。按照代謝特征質(zhì)譜響應(yīng)信號的強(qiáng)度值進(jìn)行缺失值補(bǔ)值。使用SIMCA-P 11.5軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析(PCA) 和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野蠶繭和家蠶繭化學(xué)成分的鑒定

為了鑒定與比較不同蠶繭中的化學(xué)成分，我們選擇了野蠶、家蠶大造品種和皓月品種3種蠶繭。皓月是我國推廣量最大、推廣面積最廣的家蠶品種之一，其繭色發(fā)白、繭大且繭絲品質(zhì)優(yōu)良；大造是歷史比較悠久的傳統(tǒng)品種，其繭色黃綠，繭絲量較低；野桑蠶采集自重慶市長壽區(qū)野外，其繭色黃，繭小而絲量低。用80%的甲醇提取了3種蠶繭的化學(xué)成分，利用UHPLC-MS進(jìn)行了8次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。通過陽離子模式和陰離子模式的UHPLC-MS對野蠶、大造和皓月蠶繭的提取物進(jìn)行了分析，獲得了3種蠶繭的代謝指紋圖譜，如圖1A所示。在陽離子模式下(圖1A)，大造繭中的化合物在1–8 min出現(xiàn)的峰與野蠶繭和皓月繭明顯不同，峰更多且更高；同樣，在陰離子模式下(圖1B)，大造繭中的化合物在5–11 min也出現(xiàn)了比野蠶繭和皓月繭更多且更高的差異峰。

對LC-MS中鑒定到的高豐度的化合物進(jìn)行注釋，發(fā)現(xiàn)其中包括了氨基酸(苯丙氨酸、亮氨酸/異亮氨酸、脯氨酸、甲基脯氨酸、乙酰絲氨酸和焦谷氨酸)、黃酮(槲皮素、異槲皮素、槲皮素- 3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-L-鼠李糖苷、槲皮素- 3-O-蕓香糖苷、山奈酚)、生物堿(神經(jīng)堿、甲基仙人掌堿、白橋樓堿、毛果蕓香次堿)、萜類(線葉澤蘭素、美洲豚草內(nèi)酯)、有機(jī)酸(檸檬酸) 和木脂素(中緬木蓮素) 等(表1和表2)。其中，陽離子模式的LC-MS鑒定到的主要化學(xué)成分是氨基酸和生物堿，陰離子模式的LC-MS鑒定到的主要化學(xué)成分是黃酮。

2.2 野蠶繭和家蠶繭中化學(xué)成分的比較分析

從PLS-DA的得分圖可以看出，陽離子模式下(圖2A)3種蠶繭樣品各自聚集在一起，且相互距離較遠(yuǎn)，說明3種蠶繭的化學(xué)成分差異較大；大造蠶繭和皓月蠶繭的組內(nèi)的各個生物學(xué)重復(fù)距離很近，表明其組內(nèi)樣品間的差異很?。欢靶Q繭的各次生物學(xué)重復(fù)之間距離很遠(yuǎn)，表明其野蠶繭組內(nèi)樣品間的差異較大。陰離子模式(圖2B)下的聚類結(jié)果和陽離子模式相似：3種蠶繭的成分差異很大，大造蠶繭和皓月蠶繭的組內(nèi)差異較小，而野蠶繭的組內(nèi)差異較大。

圖1 野蠶繭和家蠶繭的UHPLC-MS代謝指紋譜

表1 UHPLC-MS陽離子模式鑒定的野蠶繭和家蠶繭化學(xué)成分

表2 UHPLC-MS陰離子模式鑒定的野蠶繭和家蠶繭化學(xué)成分

野蠶、家蠶大造品種和皓月品種的3種蠶繭的化學(xué)成分分別存在顯著差異(圖2)。對它們中含有的各類化合物進(jìn)行比較分析后發(fā)現(xiàn)，脯氨酸、亮氨酸/異亮氨酸和苯丙氨酸在大造繭中的含量顯著高于在野蠶和皓月繭中的含量(圖3)；黃酮類植物次生代謝物在大造繭中的含量更高，包括槲皮素、異槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷、槲皮素-3-O-L-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-蕓香糖苷和山奈酚(圖3)；而神經(jīng)堿、白橋樓堿、毛果蕓香次堿、美洲豚草內(nèi)酯、線葉澤蘭素和中緬木蓮素等生物堿、萜類和木脂素類的植物次生代謝物在 野蠶繭中的含量顯著高于在家蠶繭中的含量 (圖4)。

陽離子以及陰離子模式的LC-MS都鑒定到了檸檬酸，我們之前的研究利用GC-MS的方法也從蠶繭中鑒定到了檸檬酸[7]，并且得到了相同的結(jié)果，即發(fā)現(xiàn)檸檬酸在野蠶繭中的含量最高，在大造繭中的含量次之，在皓月繭中的含量最少。陽離子模式的LC-MS鑒定到了脯氨酸，和GC-MS的結(jié)果一致[7]，都發(fā)現(xiàn)脯氨酸在大造繭中的含量更高。陽離子以及陰離子模式的LC-MS都鑒定到了線葉澤蘭素和異槲皮素(表1和表2)，并且兩種結(jié)果都顯示線葉澤蘭素在野蠶繭中的含量顯著更高，而異槲皮素在大造繭中的含量顯著更高。我們通過不同方法得到了相似的結(jié)果，證實(shí)了結(jié)果的可靠性。

圖2 野蠶繭和家蠶繭UHPLC-MS代謝數(shù)據(jù)PLS-DA分析的得分圖

圖3 三種氨基酸和六種黃酮在家蠶大造繭中的含量比在野蠶繭和家蠶皓月繭中的含量更高

2.3 蠶繭黃酮的熒光檢測

含黃酮較多的家蠶大造繭在普通光下呈黃綠色，而在紫外光(235 nm) 的激發(fā)下呈現(xiàn)出很強(qiáng)的黃綠色熒光(圖5)；家蠶皓月繭的黃酮含量很低，在普通光下呈白色，在紫外光下發(fā)出很弱的藍(lán)色熒光(圖5)；野蠶繭的黃酮含量居中，在普通光下呈深黃色，在紫外光的激發(fā)下發(fā)出淺綠色熒光(圖5)。同樣我們還觀察了蠶繭在藍(lán)光(488 nm) 和綠光(543 nm) 激發(fā)下的熒光，但所能觀察到的熒光都非常微弱?？梢?，在紫外光激發(fā)下黃酮的綠色熒光可以初步判斷蠶繭中黃酮的含量。

3 討論

之前的研究發(fā)現(xiàn)蠶絲的蛋白質(zhì)成分復(fù)雜多樣[5]，其中包含了大量的酶類，如氧化酶、轉(zhuǎn)移酶和水解酶等，它們催化的底物和產(chǎn)物大多是小分子，再加上蠶絲中還存在多種小分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，因此我們認(rèn)為蠶絲中包含的小分子成分可能也非常復(fù)雜。然而目前只有非常少的研究關(guān)注于蠶絲的小分子物質(zhì)，且這些報道多關(guān)注于蠶絲中的色素物質(zhì)。為了揭示蠶絲小分子成分的類型與生物學(xué)功能，2017年我們利用了GC-MS對蠶絲的小分子成分進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)了蠶絲中有糖類、脂類、氨基酸、烷烴、有機(jī)酸等小分子[7]。在本研究中，我們利用了基于LC-MS的技術(shù)，對蠶絲的小分子成分進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)了蠶絲中有氨基酸、有機(jī)酸、黃酮、生物堿、萜類等小分子物質(zhì)，與我們之前用GC-MS的鑒定結(jié)果有著明顯的差異。我們發(fā)現(xiàn)，GC-MS與LC-MS技術(shù)適合于鑒定不同類型的化合物，GC-MS適合于鑒定可揮發(fā)且熱穩(wěn)定的、極性較小的化合物，比如脂類、蠟質(zhì)等；而LC-MS適合于檢測黃酮、生物堿等極性較大的化合物。氨基酸和有機(jī)酸是兩者都擅長鑒定的物質(zhì)。結(jié)合GC-MS與LC-MS兩種技術(shù)可以更全面地解析樣品中的化學(xué)成分。

圖4 六種次生代謝物在野蠶繭中的含量比在家蠶繭中的含量更高

圖5 野蠶繭絲、家蠶大造繭絲和皓月繭絲在紫外光下的顯微圖像

我們之前的研究通過比較野蠶、家蠶大造品種和皓月品種的蠶繭，發(fā)現(xiàn)很多小分子物質(zhì)在野蠶繭中的含量都顯著高于在家蠶繭中的含量，比如有機(jī)酸、脂肪酸、醛糖、糖醇和短鏈烴類[7]，而本研究發(fā)現(xiàn)生物堿在野蠶繭中的含量也顯著高于在家蠶繭中的含量，這可能是由于野蠶的吐絲量低導(dǎo)致繭層比較薄，并且野蠶所處的環(huán)境更加惡劣，因此，野蠶繭中更多小分子物質(zhì)的存在可能是為了加強(qiáng)繭對蛹的保護(hù)能力。糖類和脂肪酸在野蠶繭中的含量較高，而氨基酸在野蠶繭中的含量較低，表明糖類和脂類物質(zhì)在野蠶絲腺中的代謝更活躍。糖、脂等物質(zhì)的代謝為絲蛋白的合成提供了能量，同時它們分泌到體外后，在蠶繭中可能也發(fā)揮著重要的作用。

本研究首次在蠶繭中鑒定到了生物堿[22-23]、萜類[24-25]和木脂素[26-27]，它們可能是在桑葉的次生代謝中形成，然后被蠶攝取后吸收進(jìn)入了絲腺進(jìn)而分泌到了蠶繭中。我們發(fā)現(xiàn)生物堿和有機(jī)酸在野蠶繭中的含量很高，它們都是良好的抗蟲抗菌劑[28-31]，對野蠶繭較差的防護(hù)能力能起到很好的彌補(bǔ)作用。

黃酮是另一類植物次生代謝產(chǎn)物，在大造繭中的含量更高，這與之前的研究結(jié)果類似，研究者們普遍認(rèn)為大造繭的黃綠色是源于其中含有的黃酮類物質(zhì)[32]。皓月繭中幾乎不含有黃酮而含有藍(lán)色的熒光物質(zhì)，所以顯示為藍(lán)色，但是藍(lán)色熒光物質(zhì)至今仍未被闡明[32]。蠶繭中的黃酮來源于桑葉，但是有的黃酮在家蠶體內(nèi)經(jīng)過了部分修飾[33]，導(dǎo)致其活性發(fā)生了變化。黃酮可以提高蠶繭的抗紫外性能，從而增加蠶蛹的存活率[21]。有很多研究發(fā)現(xiàn)黃酮是在植物中起防御性的次生物質(zhì)，對昆蟲的發(fā)育和生長有抑制作用。昆蟲也進(jìn)化出了多種適應(yīng)機(jī)制來對抗植物中的黃酮，例如家蠶體內(nèi)存在大量的解毒酶系，包括參與初級代謝的細(xì)胞色素P450單加氧酶和羧酸酯酶，參加次級代謝的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等[34]，它們的大量表達(dá)可以解毒槲皮素和蘆丁等次生物質(zhì)。槲皮素被家蠶吸收以后，在中腸和絲腺中被家蠶的UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(Bm-UGT10286)催化形成了槲皮素-5-O-葡萄糖苷[33]，推測黃酮的糖基化修飾是為了降低其對家蠶組織器官的毒性[35]。

4 結(jié)論

利用UHPLC-MS技術(shù)從蠶繭中鑒定到了氨基酸、有機(jī)酸、黃酮、生物堿和萜類等化合物，發(fā)現(xiàn)有機(jī)酸、生物堿、萜類等物質(zhì)在野蠶繭中的含量比在家蠶繭中的含量更高。生物堿和有機(jī)酸是良好的抗蟲抗菌劑，能夠提高野蠶繭的防護(hù)能力。氨基酸和黃酮類物質(zhì)在家蠶大造繭中的含量比在野蠶繭和家蠶皓月繭中的含量更高。黃酮類物質(zhì)是導(dǎo)致家蠶大造繭呈黃綠色的主要原因。

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Comparison of chemical constituents of wild silkworm cocoon and domestic silkworm cocoon by UHPLC-MS technology

Yan Zhang1,2, Zhaoming Dong2, Dongchao Zhao2, Haoyun Li2, Lingyan Wang1,2, Ying Lin2, and Ping Zhao2

1 College of biotechnology, Southwestern University, Chongqing 400715, China 2 Biological Science Research Center, Southwestern University, Chongqing 400715, China

Identifying and comparing the chemical constituents of wild silkworm cocoon and silkworm cocoon is of great significance for understanding the domestication of silkworm. In this study, we used high temperature and high pressure and methanol-water system to extract cocoon chemical constituents. We used UHPLC-MS to identify and compare cocoon chemical constituents of wild silkworm and domestic silkworm Dazao and Haoyue strains. The cocoon metabolic fingerprints of wild silkworm and domestic silkworm Dazao and Haoyue strains were obtained by using the UHPLC-MS in the positive ion mode and negative ion mode. By annotation, we found that cocoon chemical compounds with high abundances contained amino acids, flavonoids, alkaloids, terpenes, organic acids, and lignans. PLS-DA showed that the cocoon components were significantly different among the wild silkworm and two domestic silkworm strains Dazao and Haoyue. Proline, leucine/isoleucine and phenylalanine showed significantly higher abundances in the cocoon of domestic silkworm Dazao strain than in those of wild silkworm and domestic silkworm Haoyue strain. The flavonoid secondary metabolites are abundant in the Dazao cocoon, including quercetin, isoquercetin, quercetin 3-O-sophoroside, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside, quercetin-3-O- rutinoside, and kaempferol. The other secondary metabolites, alkaloids, terpenes and lignans, showed higher abundances in the wild silkworm cocoon than in the domestic silkworm cocoon, including neurine, candicine, pilocarpidine, artemisiifolin, eupassopin, and eudesobovatol. By exposing cocoons to UV light and observing the green fluorescence of flavonoids, we found that Dazao cocoon had the most flavonoids, and Haoyue cocoon had least flavonoids and wild silkworm cocoon had mediate flavonoids. Alkaloids and organic acids are good anti-insect and antimicrobial agents, which have high abundance in the wild silkworm cocoon and could enhance the defense ability of wild silkworm cocoon. Flavonoids are abundant in the cocoon of domestic silkworm Dazao strain, which the main factors are leading to the yellow-green cocoon of Dazao.

domestic silkworm (), wild silkworm (), cocoon, liquid chromatograph-mass spectrometer, alkaloid, flavonoid

January 15, 2019;

April 11, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31772532, 31702184), Chongqing Research Program of Basic Research and Frontier Technology (No. cstc2017jcyjAX0177), Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (No. XDJK2018C011), PhD Start-up Foundation of Southwest University (No. SWU116076).

Ping Zhao. Tel/Fax: +86-23-68250885; E-mail: zhaop@swu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31772532, 31702184)，重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃 (No. cstc2017jcyjAX0177)，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金 (No. XDJK2018C011)，西南大學(xué)博士基金 (No. SWU116076) 資助。

2019-05-27

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190524.1603.001.html

張艷, 董照明, 趙東超,等. 基于超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對野蠶繭和家蠶繭化學(xué)成分進(jìn)行比較. 生物工程學(xué)報, 2019, 35(8): 1546–1556.Zhang Y, Dong ZM, Zhao DC, et al. Comparison of chemical constituents of wild silkworm cocoon and domestic silkworm cocoon by UHPLC-MS technology. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1546–1556.

(本文責(zé)編 陳宏宇)