基于近紅外光譜實時監(jiān)測乙醇發(fā)酵過程多組分參數(shù)

王旭東，劉濤，薛闖，王子璇，孫旭東

基于近紅外光譜實時監(jiān)測乙醇發(fā)酵過程多組分參數(shù)

王旭東1，劉濤1，薛闖2，王子璇2，孫旭東1

1 大連理工大學 控制科學與工程學院，遼寧 大連 116024 2 大連理工大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024

生物量、葡萄糖濃度和乙醇濃度是乙醇發(fā)酵過程的重要參數(shù)，傳統(tǒng)的方法通常對發(fā)酵液取樣作離線測量，不僅需要采用多種儀器進行測試分析，而且耗時耗力，成為實時過程調(diào)控和優(yōu)化的障礙。文中針對這些重要過程參數(shù)提出了一個基于近紅外光譜技術的原位實時檢測方法。通過采用浸入式近紅外光譜儀對發(fā)酵溶液進行原位測量，基于多輸出最小二乘支持向量機回歸(MLS-SVR) 方法建立了利用近紅外光譜同時分析葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度的多輸出預測模型。實驗結果表明，該方法能實時準確地檢測乙醇發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度，而且相對于現(xiàn)有的偏最小二乘法(PLS) 分別對各組分建模和預測，能明顯提高測量準確性和可靠性。

乙醇發(fā)酵過程，近紅外光譜技術，乙醇濃度，在線監(jiān)測，多組分檢測

發(fā)酵工程廣泛用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化、食品、醫(yī)藥等生物制造行業(yè)[1-2]。發(fā)酵過程的參數(shù)主要分為化學參數(shù)(如pH值、溶解氧濃度等)、物理參數(shù)(如發(fā)酵溫度、攪拌轉(zhuǎn)速等) 和生物參數(shù)(基質(zhì)濃度、生物質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度等)。工程應用中主要通過調(diào)控這些參數(shù)對發(fā)酵過程進行控制和優(yōu)化。目前多數(shù)發(fā)酵過程主要對一些化學參數(shù)和物理參數(shù)可以實現(xiàn)在線測量，然而對于生物參數(shù)仍主要采用離線的測量技術，耗時較長，難以進行實時調(diào)控優(yōu)化[3-4]。

近紅外光譜技術具有對不同物質(zhì)組分的敏感性較好、非侵入檢測等優(yōu)點，近年來越來越多地用于發(fā)酵過程不同組分和生物量的檢測[5-6]。目前，少量文獻介紹了利用近紅外光譜技術對發(fā)酵過程的生物參數(shù)進行檢測，但基本上是采用離線的方法對單一生物參數(shù)進行檢測，如文獻[7]基于近紅外光譜技術離線檢測乳酸鏈球菌發(fā)酵過程的還原糖濃度、乳酸鏈球菌效價、細胞濃度和pH。文獻[8]采用近紅外光譜儀對1,3-丙二醇發(fā)酵過程的生物量給出了一個實時測量方法，但不能同時對發(fā)酵底物和產(chǎn)物的含量進行檢測。文獻[9]針對絲狀真菌發(fā)酵過程給出了基于近紅外光譜技術實時檢測生物量的方法，亦不能同時對其他組分進行測量。

在乙醇發(fā)酵過程中，葡萄糖、生物量和乙醇分別為發(fā)酵過程的基質(zhì)、生物質(zhì)和產(chǎn)物?，F(xiàn)已發(fā)展了一些對這些參數(shù)的離線檢測方法[10-12]，如采用葡萄糖氧化酶法和高效液相色譜法對葡萄糖濃度進行測量，使用氣相色譜儀法和酶學方法等測量乙醇濃度，以及使用酶標儀等測量光密度 (Optical density,) 表示生物量。葡萄糖在釀酒酵母菌的作用下發(fā)生糖酵解過程[13]，一分子葡萄糖產(chǎn)生兩分子丙酮酸，然后丙酮酸轉(zhuǎn)化成乙醇。乙醇發(fā)酵過程為生長偶聯(lián)型發(fā)酵過程，發(fā)酵過程中的基質(zhì)濃度和生物量變化都會對產(chǎn)物濃度帶來影響，因此需要對乙醇發(fā)酵過程中葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度建立聯(lián)合標定同時進行實時檢測。然而目前對乙醇發(fā)酵過程各組分同時在線測量的研究成果很少?，F(xiàn)有研究[7-9]主要采用偏最小二乘法 (PLS) 對發(fā)酵過程各種組分分別建立近紅外光譜標定模型，以用于離線或?qū)崟r檢測，未考慮采用近紅外光譜同時對多種組分進行建模和預測。然而近期研究[14]指出，采用多輸出支持向量機回歸 (MLS-SVR) 方法對多變量輸出建立聯(lián)合標定模型，能有效利用多變量輸出之間的相關性，達到更好的檢測可靠性和測量精度。

文中針對乙醇發(fā)酵過程，建立基于近紅外光譜儀對葡萄糖濃度、生物量及乙醇濃度原位在線測量的實驗平臺，基于MLS-SVR算法對乙醇發(fā)酵過程中生葡萄糖濃度、生物量以及乙醇濃度建立聯(lián)合標定定量分析模型。通過實驗測試，驗證說明針對近紅外光譜基于MLS-SVR建立的多變量標定模型能夠有效地對乙醇發(fā)酵過程葡萄糖濃度、生物量以及乙醇濃度進行實時測量。

1 材料與方法

1.1 乙醇發(fā)酵過程在線監(jiān)測實驗平臺與數(shù)據(jù)采集

為本文研究工作建立的乙醇發(fā)酵過程在線監(jiān)測實驗平臺如圖1所示。其中發(fā)酵罐容量為2.5 L，罐中的溫度、pH值、攪拌槳轉(zhuǎn)速等由發(fā)酵控制設備控制。利用鉑金溫度計PT100測量發(fā)酵罐中溫度，通過加熱裝置及循環(huán)冷卻水進行控溫。通過NaOH溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度，由pH計實時檢測發(fā)酵罐內(nèi)pH值。通過電動攪拌槳對發(fā)酵罐中溶液進行均勻攪拌?？紤]到在發(fā)酵初期和發(fā)酵末期中產(chǎn)氣量較少，直接使用尾氣分析儀測量尾氣可能會造成測量不準確，因此如圖所示進行循環(huán)通氣檢測發(fā)酵過程中O2和CO2濃度，以保證實時尾氣檢測的可靠性。將近紅外光譜分析儀的浸入式探頭采用酒精清潔除菌后插入發(fā)酵罐中，進行實時采集發(fā)酵罐中溶液組分對近紅外光譜的吸光度，所有檢測信號由監(jiān)控電腦進行實時顯示。

圖1 乙醇發(fā)酵過程在線監(jiān)測實驗平臺

本研究采用ABB公司制造的TALYS-AS531傅里葉近紅外光譜分析儀以及配套的浸入式漫反射探頭采集近紅外光譜，并由Horizon MB軟件進行光譜參數(shù)設置和數(shù)據(jù)預處理。光譜采集設置：測量波數(shù)范圍為4 000–12 000 cm–1，儀器分辨率為16 cm–1，光譜掃描次數(shù)為64次，檢測器增益為237.84，采集近紅外光譜以空氣為參考背景。發(fā)酵過程控制設備型號為 (KoBioTech KBT-2.5L)。采用液相色譜儀 (Waters) 測量發(fā)酵液葡萄糖濃度，采用氣相色譜儀 (Agilent 6890 Series GC System)測量發(fā)酵液的乙醇濃度，采用Multiskan Ascent 酶標儀測量發(fā)酵液的生物量 (采用表示)。使用西安智琦公司制造的尾氣分析儀檢測發(fā)酵過程產(chǎn)生的尾氣，其中IRME-M紅外氣體分析儀可對CO2濃度進行檢測，電化學式氧分析儀可對O2濃度進行檢測。通過監(jiān)控計算機監(jiān)視對發(fā)酵液實時采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)。

1.2 實驗材料配置

本實驗所用的菌種為釀酒酵母4126菌種，由大連理工大學生命科學與技術學院提供及保藏。發(fā)酵實驗前需要對種子進行培養(yǎng)。在種子活化培養(yǎng)階段，接種100 μL菌種到活化培養(yǎng)基中，然后將培養(yǎng)基放入搖床中，于30 ℃、150 r/min條件下進行24 h的活化。將活化后的菌種接入種子培養(yǎng)基，同樣在上述搖床條件下進行12 h的培養(yǎng)。種子培養(yǎng)基和活化培養(yǎng)基由葡萄糖 (20 g/L)、蛋白胨 (20 g/L) 和酵母菌提取粉 (10 g/L) 組成。

菌種經(jīng)過活化培養(yǎng)后，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵實驗。發(fā)酵開始前使用空氣泵對發(fā)酵罐通入空氣，直到尾氣分析儀中顯示發(fā)酵罐中氣體組分濃度和空氣一致時，停止空氣泵。發(fā)酵過程中發(fā)酵罐內(nèi)溫度設置為30 ℃，pH值維持在5，電動攪拌槳的轉(zhuǎn)速設置為150 r/min，以保證發(fā)酵液為均相狀態(tài)。發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖 (60 g/L)、蛋白胨 (3 g/L) 和酵母菌提取粉 (5 g/L) 組成。

1.3 參考數(shù)據(jù)與光譜數(shù)據(jù)分析

利用上述實驗平臺采集5批發(fā)酵過程數(shù)據(jù)用于建立近紅外光譜標定模型，每個取樣時間點采集3次光譜數(shù)據(jù)和3組樣本做離線檢測參考數(shù)據(jù)。按照3∶1的比例分為校正集和驗證集，如表1所示，這里將離線檢測參考數(shù)據(jù)的最大值和最小值歸入校正集中，用于建立模型，以保證用于建立光譜標定模型的參考數(shù)據(jù)范圍大于驗證集，從而確保以模型內(nèi)插方式實現(xiàn)可靠的預測。

圖2示例給出了對其中一個批次乙醇發(fā)酵過程采集的近紅外光譜吸光度數(shù)據(jù)。由圖2可以看出，在波數(shù)段5 500–6 500 cm–1及8 000– 12 000 cm–1范圍內(nèi)的近紅外光譜相較于其他波段具有明顯的變化特征。需要說明，生物反應器的結構差異 (例如攪拌槳和擋板的尺寸和方向等) 會改變培養(yǎng)基中的物理特性，從而會影響光譜吸收特性[15]。隨著發(fā)酵過程的進行，生物量的增加不僅會影響發(fā)酵罐中各物質(zhì)成分含量，還會影響罐中顏色、密度和粘度等物理特性，當然也會影響細胞的生理代謝特性。圖2中最明顯的變化為基線漂移，造成基線漂移是由于發(fā)酵過程的物理特性變化 (例如氣泡) 使光源散射。通氣、攪拌速度、溫度、pH等都會造成一定程度的光譜變化。為了消除環(huán)境條件變化對光譜測量帶來的擾動，文中采用了一階導數(shù)的光譜預處理方法，用于消除基線和背景漂移對光譜造成的影響，增強光譜的差異，從而提高檢測精度和可靠性[16-17]。

表1 校正集與驗證集數(shù)據(jù)分析

圖2 乙醇發(fā)酵過程近紅外光譜圖

1.4 建模方法

構建如下形式的映射函數(shù)：

取對應的Lagrange函數(shù)為

由KKT條件[18]可建立下列線性方程組進行求解：

根據(jù)上述方程組的求解，確定多輸出的擬合函數(shù)為

需要說明，上式 (5) 中的核函數(shù)選取為常用的徑向基核 (RBF) 函數(shù)[19-20]：

1.5 模型評價指標

為了評估近紅外光譜標定模型對葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度的預測性能，這里采用預測集均方根誤差RMSEP (Root-mean-square error of prediction)、相關系數(shù)2(Correlation coefficient) 和范圍誤差比RPD (Ration of performance to standard deviate) 評價指標[23-24]，其計算公式分別為：

2 結果與分析

2.1 模型預測性能分析

分別用多輸出MLS-SVR算法和單輸出PLS算法建立光譜標定模型，然后使用已知的驗證集數(shù)據(jù)對這兩種標定模型進行驗證。圖3和圖4分別表示了這兩種標定模型的預測效果，其中橫坐標為離線儀器檢測的參考值，縱坐標為基于近紅外光譜數(shù)據(jù)的預測值?？梢钥闯?，多輸出MLS-SVR光譜標定模型對葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度的預測比較準確地擬合驗證集數(shù)據(jù)，建模樣本和驗證集數(shù)據(jù)在參考線附近分布比較緊致。相較之下，單輸出PLS光譜標定模型的預測結果和校正集數(shù)據(jù)擬合較為松散。

兩種光譜標定模型的預測性能評價如表2所示。可以看到，多輸出MLS-SVR光譜標定模型對于葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度預測的RMSEP都較小，由此驗證說明聯(lián)合標定模型的預測準確性相對于PLS建立的獨立標定模型有明顯提高。而且該聯(lián)合標定模型對應的2亦相對較大，說明模型對于驗證集的預測值同測量參考值相關性更高。尤其指出，對于生物量 () 預測，聯(lián)合標定模型對應的RPD為18.593 3，相較于PLS獨立標定模型有顯著提高，可用于過程實時控制和優(yōu)化。同時，聯(lián)合標定模型對于葡萄糖濃度和乙醇濃度的RPD亦都大于5，說明由此建立的定量分析模型能可靠地用于質(zhì)量預測。

2.2 實驗驗證

通過另外一個單獨批次的乙醇發(fā)酵實驗對于上述聯(lián)合標定模型進行驗證。采用PLS獨立標定模型和MLS-SVR聯(lián)合標定模型的監(jiān)測結果如圖5、6所示，其中線條數(shù)據(jù)為基于近紅外光譜采集數(shù)據(jù)實時預測結果，散點數(shù)據(jù)為采樣離線檢測參考值?？梢钥闯觯?lián)合標定模型的實時預測結果同離線檢測參考值更為貼近，然而PLS獨立標定模型的預測結果相對偏差較大，進一步驗證了聯(lián)合標定模型具有更好的預測準確性。需要說明，上述實驗中基于近紅外光譜技術建立的在線監(jiān)測聯(lián)合標定模型可以對葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度進行實時監(jiān)測，定時1 min給出一次測量結果，然而傳統(tǒng)的離線檢測方法需要取樣，并且使用多個儀器對3種生物參數(shù)分別進行測量，耗時約30–60 min。

表2 PLS與MLS-SVR模型性能指標

3 結論

文中提出了一個基于近紅外光譜技術原位實時檢測乙醇發(fā)酵過程葡萄糖濃度、生物量以及乙醇濃度的方法?？紤]到乙醇發(fā)酵過程為生長偶聯(lián)型發(fā)酵過程，文中采用多變量輸出預測的MLS-SVR方法來建立上述關鍵過程參數(shù)的聯(lián)合標定模型。通過對乙醇發(fā)酵過程葡萄糖濃度、生物量和乙醇濃度進行在線監(jiān)測的實驗，并且與現(xiàn)有的PLS獨立標定建模方法進行實驗對比，驗證了聯(lián)合標定模型相對于獨立標定模型有更好的預測精度和可靠性，且相較于傳統(tǒng)的離線檢測方法具有更好的實時性。由于近紅外光譜對發(fā)酵過程中存在含氫基團的物質(zhì) (如丙酮、丁酮、乙醇、蛋白、油脂等) 具有較好的敏感性，因此文中方法對這類生物質(zhì)發(fā)酵過程在線檢測多組分參數(shù)具有很好的應用優(yōu)勢。當然，對于更為復雜的發(fā)酵過程，有待于進一步探討如何基于近紅外光譜分析有效和準確地同時檢測相近組分的含量及其實時變化率，以及發(fā)酵過程質(zhì)量預測和異常檢測。

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On-line monitoring of multiple component parameters during ethanol fermentation by near-infrared spectroscopy

Xudong Wang1, Tao Liu1, Chuang Xue2, Zixuan Wang2, and Xudong Sun1

1 School of Control Science and Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China 2 School of Life Science and Biotechnology,Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China

The quantity of biomass, glucose concentration and ethanol concentration are important parameters in ethanol fermentation. Traditional methods are usually based on samples for off-line measurement, which not only requires multiple instruments for test and analysis but also consumes notable time and effort, and therefore is inconvenient for real-time process control and optimization. In this study, an-detection method based on the near-infrared (NIR) spectroscopy is proposed for measuring the above process parameters in real time. The-measurement is carried out by using an immersion type NIR spectroscopy. A multi-output prediction model for simultaneously estimating the quantity of glucose, biomass and ethanol is established based on a multi-output least-squares support vector regression algorithm. The experimental results show that the proposed method can precisely measure the quantity of glucose, biomass and ethanol during the ethanol fermentation process. Compared to the existing partial-least-squares method for modeling and prediction of individual components, the proposed method could evidently improve the measurement accuracy and reliability.

ethanol fermentation process, near-infrared (NIR) spectroscopy, ethanol concentration, on-line monitoring, detection of multiple components

January 6, 2019;

March 7, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 61633006), the Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (No.DUT18ZD201).

Tao Liu. Tel: +86-411-84706465; Fax: +86-411-84706706; E-mail: tliu@dlut.edu.cn

國家自然科學基金(No. 61633006)，大連理工大學重點培育基金項目 (No. DUT18ZD201) 資助。

王旭東, 劉濤, 薛闖, 等. 基于近紅外光譜實時監(jiān)測乙醇發(fā)酵過程多組分參數(shù). 生物工程學報, 2019, 35(8): 1491–1499.Wang XD, Liu T, Xue C, et al. On-line monitoring of multiple component parameters during ethanol fermentation by near-infraredspectroscopy. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1491–1499.

(本文責編 郝麗芳)