藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)的發(fā)展與展望

郗欣彤，張杉杉，毛紹名，欒國(guó)棟，羅泉，呂雪峰

藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)的發(fā)展與展望

郗欣彤1,2，張杉杉2，毛紹名1，欒國(guó)棟2，羅泉2，呂雪峰2

1 中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004 2 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所 中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

生物煉制技術(shù)體系是緩解能源和環(huán)境危機(jī)，推動(dòng)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要選擇，而充足的糖原料供應(yīng)是生物煉制的基礎(chǔ)。藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖是一種潛力巨大的新型糖原料供應(yīng)路線?；诟咝У乃{(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳細(xì)胞工廠，可以在單平臺(tái)上以太陽(yáng)能為驅(qū)動(dòng)將二氧化碳和水直接轉(zhuǎn)化為蔗糖，過(guò)程簡(jiǎn)單、產(chǎn)品明確、易于提取，而且可以同時(shí)達(dá)到固碳減排和供應(yīng)糖原料的效果，具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值。本文回顧了藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，從合成機(jī)制、代謝工程策略、技術(shù)延伸應(yīng)用等層面對(duì)其最新進(jìn)展和所遇到的問(wèn)題進(jìn)行了總結(jié)介紹，并對(duì)該技術(shù)未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行了展望。

藍(lán)細(xì)菌，蔗糖，光合作用，代謝工程，鹽脅迫

當(dāng)今世界，人類社會(huì)高度繁榮的物質(zhì)文明是在石化資源煉制體系的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的，然而這種發(fā)展模式正面臨著來(lái)自資源和環(huán)境兩方面的危機(jī)。以微生物發(fā)酵與轉(zhuǎn)化為核心的生物煉制技術(shù)體系，通過(guò)天然或人工設(shè)計(jì)、改造的微生物細(xì)胞工廠，將各類可再生資源以環(huán)境友好型方式轉(zhuǎn)化為各類化學(xué)品，可以為社會(huì)可持續(xù)發(fā)展提供新的基礎(chǔ)和動(dòng)力[1]。對(duì)于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母等模式化的異養(yǎng)微生物細(xì)胞工廠而言，糖原料是其生物煉制過(guò)程的基礎(chǔ)和保障[2]。目前，糖原料的獲取主要有3種途徑：淀粉類糧食作物 (如玉米等)[6-7]、纖維類生物質(zhì) (如秸稈等)、蔗糖類植物 (如甘蔗等)。盡管上述3種途徑都有很大的發(fā)展?jié)摿?，但同樣都面臨著一些瓶頸問(wèn)題：淀粉類糧食作物制備糖原料存在“與人爭(zhēng)糧”的問(wèn)題，纖維類生物質(zhì)制備糖原料存在預(yù)處理酶水解糖化成本過(guò)高的問(wèn)題，蔗糖類植物存在種植區(qū)域限制的問(wèn)題[3]。因此，開(kāi)發(fā)高效的糖類合成技術(shù)、拓寬糖類供應(yīng)來(lái)源，建立可持續(xù)、低成本、不受區(qū)域限制的原料糖制備新路線，對(duì)于降低原料成本、促進(jìn)生物煉制技術(shù)體系產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程具有重要意義。

藍(lán)細(xì)菌是一類進(jìn)行放氧光合作用的原核微生物，能利用光能和二氧化碳自養(yǎng)生長(zhǎng)，廣泛分布于海洋、陸地、淡水等各種生態(tài)環(huán)境中[4]。相比較于高等植物和真核微藻，藍(lán)細(xì)菌具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速而且易于進(jìn)行遺傳操作的特點(diǎn)，通過(guò)天然代謝途徑的修飾或異源代謝途徑的引入，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)其胞內(nèi)碳流、能量流的重新分配，促進(jìn)各種天然或非天然代謝產(chǎn)物的合成[5-6]。糖類物質(zhì)是藍(lán)細(xì)菌中重要的碳水化合物存在形式，也是具有代表性的藍(lán)細(xì)菌光合生物合成產(chǎn)品[7]。藍(lán)細(xì)菌天然地可以合成從葡萄糖、果糖等單糖，蔗糖、海藻糖等二糖，到糖原等大分子多糖的眾多類型的糖類物質(zhì)。蔗糖是廣泛研究的、也是最具代表性的藍(lán)細(xì)菌糖類代謝產(chǎn)物。大多數(shù)淡水藍(lán)細(xì)菌藻株在面臨鹽脅迫時(shí)，會(huì)在胞內(nèi)合成并富集蔗糖作為相容性溶質(zhì)，以維持胞內(nèi)外滲透壓平衡[8]。而通過(guò)代謝工程改造，已經(jīng)成功地在部分工程藻株中實(shí)現(xiàn)了蔗糖從胞內(nèi)向胞外的高效分泌，使其可以在培養(yǎng)液中積累，大幅度提高了藍(lán)細(xì)菌蔗糖的產(chǎn)量[9]，有效提升了藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖技術(shù)的工程化應(yīng)用潛力。

相比于傳統(tǒng)的糖原料制備技術(shù)，特別是與各種植物生物質(zhì)糖化過(guò)程相比，使用藍(lán)細(xì)菌進(jìn)行蔗糖分子的合成和分泌，不需要高能耗、高成本的原料預(yù)處理過(guò)程，即實(shí)現(xiàn)從二氧化碳和太陽(yáng)能向簡(jiǎn)單而明確的糖組分的直接轉(zhuǎn)化，在工藝和成本上將更具優(yōu)勢(shì)，是一種極具潛力的糖原料生產(chǎn)路線。本文將從藍(lán)細(xì)菌合成蔗糖的生理和代謝機(jī)制、光驅(qū)固碳產(chǎn)糖細(xì)胞工廠的代謝工程開(kāi)發(fā)策略、光驅(qū)固碳產(chǎn)糖技術(shù)的擴(kuò)展應(yīng)用等方面對(duì)該技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀和所面臨的問(wèn)題進(jìn)行總結(jié)，并對(duì)其未來(lái)前景和發(fā)展方向進(jìn)行展望。

1 藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成的生理、遺傳和代謝背景

1.1 藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成的生理意義

藍(lán)細(xì)菌廣泛分布在各種生態(tài)環(huán)境中，需要面臨各種類型環(huán)境因子和營(yíng)養(yǎng)條件的波動(dòng)[4]。高濃度鹽離子 (Na+、K+等) 造成的鹽脅迫是一種常見(jiàn)而典型的環(huán)境脅迫作用。鹽脅迫條件下，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞需要面臨復(fù)合的脅迫因子刺激，既有高的鹽離子濃度 (離子脅迫)，也有強(qiáng)的溶液滲透壓(滲透脅迫)，會(huì)對(duì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定與功能保持造成嚴(yán)重威脅。為了適應(yīng)高鹽條件下的滲透脅迫，藍(lán)細(xì)菌普遍進(jìn)化出了胞內(nèi)快速合成并積累相容性溶質(zhì)以維持胞內(nèi)外滲透壓平衡的適應(yīng)性生存策略。相容性溶質(zhì)是指微生物細(xì)胞在高滲透壓環(huán)境下，為了提高胞內(nèi)水活度而合成，并通過(guò)高濃度積累來(lái)維持細(xì)胞體積和膨壓，而且對(duì)細(xì)胞正常代謝活性不造成影響的一類小分子代謝物[10]。不同藍(lán)細(xì)菌藻株中，合成和積累的相容性溶質(zhì)的類型與藻株的鹽脅迫耐受能力密切相關(guān)。通常意義上，鹽耐受能力在0.6 mol/L NaCl以下的藻株被稱為低耐鹽藻株，一般合成海藻糖或/和蔗糖作為相容性溶質(zhì) (例如魚(yú)腥藻PCC 7120、聚球藻PCC 7942等)；鹽耐受能力在1.7 mol/L NaCl以下的藻株歸為中度耐鹽藻株，通常合成甘油葡萄糖苷為相容性溶質(zhì) (例如集胞藻PCC 6803)；鹽耐受能力達(dá)到3 mol/L NaCl及以上的藻株為高度耐鹽藻株，則主要合成甜菜堿或谷氨酸甜菜堿作為相容性溶質(zhì) (例如鹽澤螺旋藻、鹽生隱桿藻等)[8,11-12]。蔗糖是淡水藻株和部分海水藻株中最具代表性的相容性溶質(zhì)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了至少60株藍(lán)細(xì)菌藻株能在胞內(nèi)合成蔗糖作為相容性溶質(zhì)以抵抗高滲透壓脅迫[8]。

除了作為抵抗鹽脅迫的相容性溶質(zhì)進(jìn)行應(yīng)激性合成外，蔗糖在部分藍(lán)細(xì)菌藻株中還作為輔助性的碳匯途徑存在。作為藍(lán)細(xì)菌適應(yīng)晝夜節(jié)律、應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的重要機(jī)制，在光照條件下通過(guò)卡爾文循環(huán)固定的碳往往處于“溢出”狀態(tài)，超出細(xì)胞生長(zhǎng)和復(fù)制所需；而這部分溢出的碳以“碳匯”的形式儲(chǔ)存于糖原等多糖大分子和甘油葡萄糖苷、蔗糖等小分子溶質(zhì)中，可以支撐藍(lán)細(xì)菌在黑暗條件、饑餓條件下細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的需要[13-15]。在正常條件下，糖原代謝是最主要也是最重要的碳匯機(jī)制，而蔗糖、甘油葡萄糖苷合成機(jī)制的存在則為藍(lán)細(xì)菌碳匯網(wǎng)絡(luò)的可塑性和柔性提供了保證。在聚球藻PCC 7002中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)糖原合成途徑被阻斷時(shí)，突變株細(xì)胞內(nèi)蔗糖含量會(huì)顯著增加，以作為“溢出”碳流的重新分配的重要途徑[16-17]。當(dāng)糖原合成能力缺失的PCC 7002藻株處于黑暗環(huán)境下時(shí)，其胞內(nèi)增加的蔗糖含量可以為細(xì)胞呼吸和自發(fā)酵等異化作用提供底物支持，部分替代糖原的作用[16]。

1.2 藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成的代謝機(jī)制

藍(lán)細(xì)菌中的蔗糖合成代謝途徑已經(jīng)被清楚揭示 (圖1)，與植物中的蔗糖合成途徑相同，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞中的蔗糖合成主要由蔗糖磷酸合成酶 (Sucrose-phosphate synthase，SPS，EC 2.4.1.14) 和蔗糖磷酸磷酸化酶 (Sucrose phosphatase，SPP，EC 3.1.3.24) 兩個(gè)酶順序催化完成。首先是，UDP-葡萄糖和果糖-6-磷酸在蔗糖磷酸合成酶作用下合成蔗糖-6-磷酸并釋放一個(gè)UDP分子；進(jìn)而，蔗糖-6-磷酸在蔗糖磷酸磷酸化酶的作用下水解生成蔗糖并釋放一個(gè)無(wú)機(jī)磷酸分子。除了上述SPS-SPP途徑外，一些絲狀藍(lán)細(xì)菌中 (如魚(yú)腥藻PCC 7120、PCC 7119、ATCC 29413) 還存在另一條蔗糖合成途徑，由蔗糖合成酶 (Sucrose synthase，SuS，EC 2.4.1.13) 催化從UDP-葡萄糖 (或ADP-葡萄糖) 和果糖到蔗糖和UDP (或ADP) 的可逆轉(zhuǎn)化。但在生理狀態(tài)下，SuS途徑主要催化蔗糖的水解過(guò)程而非合成過(guò)程[18-20]。在蔗糖合成途徑之外，能進(jìn)行蔗糖合成的藍(lán)細(xì)菌藻株的基因組上通常還會(huì)有蔗糖水解酶 (Invertase，INV，EC 3.2.1.26) 的編碼基因，該酶催化蔗糖的降解過(guò)程，將蔗糖水解為葡萄糖和果糖，而與SuS不同的是，invertase催化的蔗糖水解反應(yīng)為非可逆反應(yīng)。

圖1 藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成和代謝網(wǎng)絡(luò)以及針對(duì)性的代謝工程改造策略

1.3 藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成的調(diào)控機(jī)制

與清晰的蔗糖合成和降解途徑形成鮮明對(duì)比的是，現(xiàn)階段對(duì)藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成調(diào)控機(jī)制方面知之甚少，具體體現(xiàn)在鹽脅迫信號(hào)感知方式、信號(hào)傳遞途徑以及蔗糖合成誘導(dǎo)機(jī)制等3個(gè)層面上。首先對(duì)產(chǎn)糖藍(lán)細(xì)菌感知鹽脅迫的機(jī)制仍有疑問(wèn)。如前所述，鹽脅迫條件下，藍(lán)細(xì)菌所面臨的是復(fù)合的脅迫環(huán)境，既有高濃度的鹽離子脅迫，又有強(qiáng)滲透壓脅迫，而已有證據(jù)表明高濃度鹽離子和強(qiáng)滲透壓對(duì)細(xì)胞是兩種不同的脅迫信號(hào)。日本的Murata研究組發(fā)現(xiàn)集胞藻PCC 6803在面對(duì)鹽脅迫 (高濃度NaCl) 和滲透脅迫 (高濃度山梨醇) 時(shí)，其基因轉(zhuǎn)錄圖譜差別極大，意味著這兩種脅迫引發(fā)了不同基因系列轉(zhuǎn)錄的調(diào)控[21]。該研究組在對(duì)聚球藻PCC 7942的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，能產(chǎn)生相同滲透勢(shì)的滲透脅迫 (高濃度山梨醇) 與鹽脅迫 (高濃度NaCl) 對(duì)細(xì)胞體積造成的影響差異顯著，前者使細(xì)胞收縮了55%，而后者僅收縮了15%。這兩種脅迫對(duì)PCC 7942細(xì)胞生理、生化的影響也有很大差異，強(qiáng)滲透壓脅迫下，聚球藻PCC 7942細(xì)胞迅速失水，光系統(tǒng)會(huì)快速但可逆地失活，而其活性會(huì)在細(xì)胞重新回到等滲溶液時(shí)恢復(fù)；而高濃度NaCl脅迫首先通過(guò)強(qiáng)滲透壓引發(fā)光系統(tǒng)快速而可逆的失活，繼而由鹽離子 (Na+) 對(duì)光合作用系統(tǒng)引發(fā)不可逆的損傷和失活[22-23]。上述結(jié)果表明鹽脅迫中強(qiáng)滲透壓脅迫和高鹽離子濃度脅迫對(duì)細(xì)胞造成的影響有顯著區(qū)別，而這兩種因素在誘導(dǎo)蔗糖合成上的具體作用仍有待揭示。

鹽脅迫信號(hào)被產(chǎn)糖藍(lán)細(xì)菌感知后，如何在細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)傳遞，并引發(fā)系列的基因表達(dá)調(diào)控也并不完全清楚。微生物細(xì)胞中感知、傳導(dǎo)并響應(yīng)各種環(huán)境變化的典型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)有單元 (絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，STK) 和雙元 (組氨酸激酶-響應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，Hik-Rre) 兩類。藍(lán)細(xì)菌中，響應(yīng)鹽脅迫、滲透壓脅迫、金屬離子脅迫、溫度、光強(qiáng)等環(huán)境變化的雙元信號(hào)系統(tǒng)已經(jīng)陸續(xù)被鑒定[24-26]。在集胞藻PCC 6803中，已經(jīng)鑒定到至少4組雙元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng) (Hik33-Rre31、Hik34-Rre1、Hik16-Hik41-Rre17和Hik10-Rre3) 和一個(gè)單元信號(hào)蛋白 (SpkG) 可能與鹽脅迫和高滲透壓脅迫感知傳導(dǎo)相關(guān)[27]。而在魚(yú)腥藻PCC 7120中，雙元信號(hào)蛋白OrrA (Alr3768) 已經(jīng)被證實(shí)參與了蔗糖合成的調(diào)控[28]。但是，在現(xiàn)階段對(duì)絕大多數(shù)產(chǎn)糖藍(lán)細(xì)菌而言，對(duì)鹽脅迫信號(hào)更加具體、精確的感知和傳導(dǎo)途徑的認(rèn)識(shí)仍然是空白。

理論上，鹽脅迫信號(hào)在藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞中的傳導(dǎo)最終需要引發(fā)蔗糖合成途徑的調(diào)控，而已有的研究表明，這種調(diào)控可能同時(shí)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯、酶活等多個(gè)維度上。在集胞藻PCC 6803中，蔗糖合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄在鹽脅迫后迅速上調(diào)，在0.5 h達(dá)到最大值[29]；而聚球藻PCC 7002在鹽脅迫24 h后，和轉(zhuǎn)錄信號(hào)也顯著提高[30]。在翻譯水平上，免疫印跡分析表明，魚(yú)腥藻PCC 7120的SPS蛋白在鹽脅迫6 h后，表達(dá)量明顯提高，而將細(xì)胞重新置于正常環(huán)境時(shí) (非鹽脅迫條件)，SPS雜交信號(hào)則又降低到背景水平。與之對(duì)應(yīng)的是，非脅迫條件下SPS酶活處在相對(duì)較低的水平，在加入80 mmol/L NaCl脅迫6 h后，SPS酶活提高了3倍。當(dāng)把脅迫后的細(xì)胞重新置于基本培養(yǎng)基中，SPS酶活則下降到基礎(chǔ)水平[31]。然而，如前所述，鹽脅迫信號(hào)在感知和傳導(dǎo)途徑上認(rèn)識(shí)的缺失，也進(jìn)一步限制了對(duì)蔗糖合成途徑調(diào)控機(jī)制的精確揭示。SPS、SPP、INV等蔗糖合成和降解途徑的關(guān)鍵蛋白在鹽脅迫條件下是如何從蛋白豐度和蛋白活性上發(fā)生快速而精細(xì)變化的？離子脅迫和滲透脅迫是如何引發(fā)這些變化的？這些問(wèn)題的回答和解決將是深入理解藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成機(jī)制、解除現(xiàn)有光合固碳產(chǎn)糖對(duì)鹽脅迫的依賴、最終提升藍(lán)細(xì)菌工程藻株產(chǎn)糖效能的關(guān)鍵。

2 藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖的代謝工程策略

天然藍(lán)細(xì)菌藻株中，蔗糖的合成主要作為相容性溶質(zhì)以抵御高鹽脅迫導(dǎo)致的滲透壓失衡，當(dāng)胞內(nèi)積累的蔗糖濃度足以使細(xì)胞內(nèi)外滲透壓重新平衡時(shí)，蔗糖濃度就不會(huì)進(jìn)一步提高，其合成和降解將處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這種天然的蔗糖代謝調(diào)控模式從根本上限制了藍(lán)細(xì)菌蔗糖產(chǎn)量的提升。如圖1所示，通過(guò)代謝工程改造，打破鹽脅迫條件下藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成和調(diào)控的天然調(diào)控模式，是加強(qiáng)蔗糖合成能力、提升藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)應(yīng)用潛力的重要選擇。

2.1 蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的導(dǎo)入

解除藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成能力瓶頸的關(guān)鍵在于實(shí)現(xiàn)蔗糖的胞外分泌，而開(kāi)發(fā)藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)取得的最具突破性的進(jìn)展就是通過(guò)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的導(dǎo)入而實(shí)現(xiàn)的。2012年Ducat等將來(lái)自大腸桿菌的基因?qū)刖矍蛟錚CC 7942，首次實(shí)現(xiàn)了蔗糖的胞外分泌[9]。CscB蛋白是一種蔗糖透性酶 (Sucrose permease)，可以完成質(zhì)子/蔗糖的同向轉(zhuǎn)運(yùn)。在大腸桿菌細(xì)胞中，CscB蛋白通常促進(jìn)細(xì)胞從酸性環(huán)境中吸收蔗糖和質(zhì)子；而藍(lán)細(xì)菌的培養(yǎng)環(huán)境通常偏堿性，有利于鹽脅迫下合成的蔗糖與質(zhì)子的同時(shí)泵出。Ducat等采用IPTG誘導(dǎo)型的P啟動(dòng)子控制基因的表達(dá)，在150 mmol/L NaCl脅迫和1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下，聚球藻工程藻株蔗糖合成效率達(dá)到了28 mg/(L?h)，168 h鹽脅迫條件培養(yǎng)后產(chǎn)量達(dá)到2.7 g/L[9]。

2016年本實(shí)驗(yàn)室使用一株在高溫高光條件下能夠快速生長(zhǎng)的速生聚球藻UTEX 2973進(jìn)行蔗糖合成研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因的導(dǎo)入也可以促進(jìn)UTEX 2973中蔗糖的分泌[32]。UTEX 2973是近期發(fā)現(xiàn)的一種極具工程化應(yīng)用潛力的藍(lán)細(xì)菌藻株。該藻株在基因組上與聚球藻PCC 7942具有高達(dá)99.8%的相似性 (差異僅包括55個(gè)SNP、一個(gè)188.6 kb大片段的位置翻轉(zhuǎn)以及一個(gè)片段缺失)，而該藻株卻表現(xiàn)出了顯著提高的環(huán)境脅迫適應(yīng)性和生長(zhǎng)速度，在500 μmol photons/(m2·s) 高光和41℃高溫培養(yǎng)條件下，其代增時(shí)間只有2.1 h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)此前報(bào)道過(guò)的各種模式藻株[33]。研究還發(fā)現(xiàn)，該藻株具有極強(qiáng)的碳水化合物合成潛力，其250 μmol photons/(m2·s)光照和38 ℃的溫度條件下，糖原積累量可以達(dá)到干重的50%左右；而受到鹽脅迫時(shí)，該藻株同樣在胞內(nèi)合成并積累蔗糖作為主要的相容性溶質(zhì)。通過(guò)將基因?qū)險(xiǎn)TEX 2973基因組，在鹽脅迫條件下工程藻株中合成的蔗糖中95%以上會(huì)分泌至胞外；當(dāng)使用KCl替代NaCl作為脅迫物時(shí)，因?yàn)镵+對(duì)細(xì)胞的毒性弱于Na+，蔗糖合成速率可以進(jìn)一步提高到35.5 mg/(L?h)，而單批次培養(yǎng)的蔗糖產(chǎn)量達(dá)到3.5 g/L。該部分研究中還發(fā)現(xiàn)，以KCl為脅迫鹽時(shí)，UTEX 2973-CscB藻株細(xì)胞可以通過(guò)離心收集-重懸培養(yǎng)的模式進(jìn)行半連續(xù)式蔗糖合成，經(jīng)過(guò)7次采集 (每次3 d)，累計(jì)蔗糖產(chǎn)量可達(dá)8.7 g/L[32]。

值得注意的是，藍(lán)細(xì)菌中蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)受到宿主遺傳、生理和代謝背景的影響。本實(shí)驗(yàn)室將基因?qū)爰錚CC 6803時(shí)，發(fā)現(xiàn)該基因無(wú)法正常表達(dá)和發(fā)揮功能，工程藻株中合成的蔗糖無(wú)法有效分泌至胞外[34]。這就意味著在未來(lái)高效光驅(qū)固碳合成蔗糖細(xì)胞工廠的開(kāi)發(fā)過(guò)程中，分泌蛋白與底盤藻株之間的適配性也是需要考慮的問(wèn)題，通過(guò)資源挖掘和酶工程改造提高蔗糖分泌蛋白在特定的藍(lán)細(xì)菌底盤藻株中的表達(dá)和活性，將成為提升蔗糖分泌、強(qiáng)化蔗糖合成的重要策略。

2.2 蔗糖合成途徑的強(qiáng)化和降解途徑的阻斷

除了解決蔗糖分泌的瓶頸問(wèn)題之外，對(duì)藍(lán)細(xì)菌中直接參與蔗糖合成和降解代謝的節(jié)點(diǎn)基因進(jìn)行改造，也是提高蔗糖合成效率的重要策略，主要包括蔗糖合成途徑的強(qiáng)化和降解途徑的阻斷兩方面。本實(shí)驗(yàn)室在針對(duì)集胞藻PCC 6803的蔗糖合成能力強(qiáng)化研究中發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)蔗糖合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)對(duì)提升蔗糖產(chǎn)量有重要意義[34]。通過(guò)蔗糖合成酶、蔗糖磷酸合成酶以及UDP葡萄糖焦磷酸酶三個(gè)基因的共同表達(dá)，可以將工程藻株的蔗糖產(chǎn)量提升2倍；而阻斷蔗糖合成競(jìng)爭(zhēng)途徑甘油葡萄糖苷合成的關(guān)鍵基因，可以將藻株蔗糖產(chǎn)量提升1.5倍；當(dāng)兩種策略結(jié)合時(shí)，獲得的工程藻株相比PCC6803野生型藻株的蔗糖產(chǎn)量提升了4倍[34]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)聚球藻PCC 7942的改造中同樣發(fā)現(xiàn)，在導(dǎo)入了基因的工程藻株中，過(guò)量表達(dá)PCC 7942自身的蔗糖合成酶基因，可以將工程藻株的蔗糖產(chǎn)量提高74%；而在和共同過(guò)量表達(dá)的藻株中，的過(guò)量表達(dá)可以使單位細(xì)胞的蔗糖合成能力提高3倍 (590 mg/L提高至超過(guò)1 760 mg/L)[35]。對(duì)于處于鹽脅迫狀態(tài)的藍(lán)細(xì)菌藻株而言，當(dāng)具有足夠的碳源供應(yīng)時(shí)，蔗糖合成途徑的催化活性成為蔗糖合成的限速步驟，強(qiáng)化合成途徑關(guān)鍵蛋白的表達(dá)可以有效提升蔗糖的生產(chǎn)效率和實(shí)際產(chǎn)量。

如前所述，蔗糖作為藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞中天然的相容性溶質(zhì)，其自身代謝存在內(nèi)源性的平衡機(jī)制，蔗糖水解酶invertase的存在可以將過(guò)度積累的蔗糖迅速降解為葡萄糖和果糖，繼而經(jīng)過(guò)磷酸化后進(jìn)入中心代謝。2012年，Ducat等的工作中首次證明在導(dǎo)入了基因的PCC7942藻株中敲除水解酶基因，可以將蔗糖產(chǎn)量進(jìn)一步提升15%。當(dāng)把的敲除與糖原合成節(jié)點(diǎn)基因的敲除相結(jié)合時(shí)，最終蔗糖產(chǎn)量得到25%的提高[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，在蔗糖合成途徑得到強(qiáng)化的PCC 6803工程藻株[34]中敲除水解酶基因，可以將蔗糖產(chǎn)量進(jìn)一步提高40%[36]。

2.3 糖原代謝的擾動(dòng)

光合微藻的一個(gè)普遍特征是胞內(nèi)存在天然的碳匯機(jī)制，以儲(chǔ)存卡爾文循環(huán)固定的、超出細(xì)胞正常生長(zhǎng)所需的碳源和能量，藍(lán)細(xì)菌中最重要、最具代表性的碳匯機(jī)制是糖原的代謝。糖原代謝的存在對(duì)于藍(lán)細(xì)菌抵抗環(huán)境脅迫、適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)動(dòng)態(tài)變化具有重要意義，然而對(duì)于化學(xué)品的光驅(qū)固碳合成而言，糖原合成被普遍地視為一種主要的競(jìng)爭(zhēng)途徑[37]。Xu等針對(duì)聚球藻PCC 7002的研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)敲除兩個(gè)糖原合成酶基因 (和) 可以徹底阻斷PCC 7002細(xì)胞的糖原合成和積累；當(dāng)糖原合成能力缺失的突變株遇到鹽脅迫時(shí)，胞內(nèi)積累的蔗糖和甘油葡萄糖苷含量均有所提升，其中蔗糖含量大約提高3倍[38]。Ducat在導(dǎo)入了基因的PCC 7942工程藻株中，敲除糖原合成的限速酶ADP-葡萄糖焦磷酸化酶編碼基因，使工程藻株的蔗糖產(chǎn)量提高了5%–10%[9]。但是需要注意的是，基因的敲除，對(duì)細(xì)胞的生理魯棒性造成了顯著的影響，面對(duì)鹽脅迫時(shí)，工程細(xì)胞的生長(zhǎng)代時(shí)從12 h延長(zhǎng)至43.5 h，即使經(jīng)過(guò)馴化后，仍然達(dá)到20 h[9]，從光驅(qū)固碳產(chǎn)糖全過(guò)程的綜合效益來(lái)考量，通過(guò)基因敲除來(lái)阻斷糖原合成是否合理仍有待評(píng)價(jià)。

2018年，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)糖原代謝和蔗糖合成的關(guān)系取得了新的認(rèn)識(shí)。在同樣導(dǎo)入了基因的PCC 7942工程藻株中，使用一個(gè)茶堿調(diào)控的核糖開(kāi)關(guān)控制GlgC蛋白的豐度，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖原含量的人工調(diào)控。然而，在該系統(tǒng)下我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)工程藻株中糖原量減少時(shí)，鹽脅迫條件下蔗糖含量不但沒(méi)有提升反而有所降低，而且在調(diào)控范圍內(nèi)，蔗糖產(chǎn)量與糖原含量成正相關(guān)。進(jìn)一步的研究表明，當(dāng)在和同時(shí)過(guò)量表達(dá)的工程藻株中，使用強(qiáng)啟動(dòng)子P過(guò)量表達(dá)，將糖原含量占細(xì)胞干重比從30%提高至50%時(shí)，藻株的蔗糖合成能力提升了30%–70%，鹽脅迫2 d內(nèi)，蔗糖產(chǎn)量從335 mg/L (7 mg/(L?h)) 提高至超過(guò)1 170 mg/L (24.4 mg/(L·h))[35]。

在本實(shí)驗(yàn)室的工作[35]和Ducat等的研究工作[9]中，糖原合成-積累與藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成能力表現(xiàn)出不同的關(guān)系，而這種不同可能是由培養(yǎng)模式造成的。在Ducat實(shí)驗(yàn)中，NaCl脅迫從培養(yǎng)初期就存在，也就是說(shuō)工程藻株中蔗糖合成與細(xì)胞生物質(zhì)積累是同步、偶聯(lián)的，在這種模式下，阻斷糖原積累，將迫使細(xì)胞將“溢出”的碳流和能量流分配給蔗糖合成這一“替代性”碳匯途徑，因此蔗糖合成會(huì)有所增加；而本實(shí)驗(yàn)室所采用的是先將藻株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)末期，然后進(jìn)行鹽脅迫，此時(shí)工程藻株的生物量積累已經(jīng)基本停止，而已經(jīng)存儲(chǔ)在糖原中的碳源可以作為“儲(chǔ)備碳庫(kù)”，為蔗糖合成提供卡爾文循環(huán)以外的補(bǔ)充碳流，因而也能提高蔗糖的合成。前后兩組研究的對(duì)比也說(shuō)明，在藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳細(xì)胞工廠的設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)過(guò)程中，針對(duì)不同環(huán)境、生理和代謝狀態(tài)，提高細(xì)胞天然碳匯機(jī)制與人工碳匯途徑之間的適配程度，合理優(yōu)化碳流分配具有重要意義。

2.4 生物量積累阻斷策略

與糖原代謝擾動(dòng)策略類似，最大限度地阻斷細(xì)胞生物質(zhì)的積累，以使光合碳流盡可能地向目標(biāo)代謝產(chǎn)物分配是最近提出的一種藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)策略。Ducat研究組在聚球藻PCC 7942中通過(guò)對(duì)一種重要響應(yīng)性調(diào)控因子RpaB (Regulator of phycobilisome-associated B) 的過(guò)量表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了工程藻株細(xì)胞生物質(zhì)積累的有效阻滯，意味著通向細(xì)胞生物質(zhì)合成途徑的光合碳流被阻斷；而在此條件下，突變株細(xì)胞的光合作用會(huì)受到嚴(yán)重的反饋抑制，光合效率極大降低；在過(guò)量表達(dá)藻株中，同時(shí)進(jìn)行蔗糖合成酶的誘導(dǎo)性過(guò)量表達(dá)時(shí)，由于光合碳流重新獲得新的“出口”，工程藻株中光合作用的反饋抑制即可消除，而蔗糖合成效率得到2倍的提升[39]。近期，荷蘭代爾夫特理工大學(xué)的研究人員將相似策略用于乙醇細(xì)胞工廠的開(kāi)發(fā)中，也取得了很好的效果，證明通過(guò)限制生物量積累來(lái)優(yōu)化碳流的控制和分配在藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)中具有良好的應(yīng)用前景[40]。

2.5 藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)糖代謝工程策略展望

對(duì)微生物細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)而言，代謝流的控制和優(yōu)化是極為重要和有效的策略。增強(qiáng)碳流、能量流向目標(biāo)代謝產(chǎn)物的分配，提高整條合成路線的原子經(jīng)濟(jì)性是提高生物合成、生物煉制技術(shù)體系經(jīng)濟(jì)競(jìng)爭(zhēng)力的關(guān)鍵。然而，從代謝流的角度上看，目前合成水平較高的藍(lán)細(xì)菌蔗糖細(xì)胞工廠 (速生聚球藻UTEX 2973中過(guò)量表達(dá)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CscB)，分配向蔗糖合成的光合碳流可以達(dá)到光合固碳總量的60%左右，用于細(xì)胞生物量合成的碳流比率只占40%左右；而在細(xì)胞生物量中可動(dòng)員潛力較大的碳水化合物儲(chǔ)備-糖原合成占細(xì)胞干重比率一般在30%–50%之間，在光合固碳總量中占比則在5%–20%范圍內(nèi)[32]。從這個(gè)角度看，對(duì)藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)而言，未來(lái)以進(jìn)一步提升蔗糖合成水平、增強(qiáng)技術(shù)的可應(yīng)用潛力為目標(biāo)，其關(guān)鍵在于“開(kāi)源”而非“節(jié)流”。僅僅通過(guò)碳源分配模式層面的優(yōu)化，很難使蔗糖合成水平獲得質(zhì)的提高，而且可能會(huì)影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)和代謝的魯棒性和適切性，以生長(zhǎng)速度和光合活性降低為代價(jià)而片面強(qiáng)調(diào)目標(biāo)產(chǎn)品碳流占比的提高，其結(jié)果往往是整個(gè)光驅(qū)固碳合成過(guò)程的效率的降低。藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖技術(shù)合成水平的突破更應(yīng)該著眼于整體提升藍(lán)細(xì)菌底盤藻株和工程藻株的光驅(qū)固碳效能，探索從根本上突破限制天然光合固碳系統(tǒng)效率和活性的機(jī)制性瓶頸，將蔗糖合成代謝網(wǎng)絡(luò)的“源頭加寬、池子挖深”，通過(guò)光合作用中固定的碳流的整體強(qiáng)化實(shí)現(xiàn)蔗糖產(chǎn)量的大幅提高。

3 基于藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)的人工合成光驅(qū)共生系統(tǒng)

3.1 人工合成光驅(qū)共生系統(tǒng)的概念驗(yàn)證

如前所述，蔗糖分泌蛋白的導(dǎo)入推動(dòng)了高效的藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成細(xì)胞工廠的成功開(kāi)發(fā)，實(shí)現(xiàn)了基于光合微藻單一平臺(tái)的、由環(huán)境中的太陽(yáng)能和二氧化碳向蔗糖的直接合成和分泌。然而，蔗糖的有效分泌也同樣提升了藍(lán)細(xì)菌工程藻株培養(yǎng)體系被異養(yǎng)微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。除了采用嚴(yán)格的生物污染控制策略、減少雜菌入侵和增殖概率的策略之外，模擬自然條件下地衣等自養(yǎng)-異養(yǎng)生物共生體系，將藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)糖藻株和能以蔗糖為碳源的異養(yǎng)微生物細(xì)胞工廠共同培養(yǎng)，人工構(gòu)建光驅(qū)共生合成系統(tǒng)以進(jìn)行蔗糖的原位利用，成為另一種可行的選擇。

2012年，Ducat等向聚球藻PCC 7942導(dǎo)入基因，實(shí)現(xiàn)了鹽脅迫條件下蔗糖的合成和分泌后，首先探索了以藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖系統(tǒng)支撐經(jīng)典模式異養(yǎng)微生物——釀酒酵母生存和生長(zhǎng)的可能性。研究人員首先證實(shí)，向培養(yǎng)聚球藻PCC 7942的BG11培養(yǎng)基中補(bǔ)充部分氮源和2%的蔗糖后，就可以用于釀酒酵母的培養(yǎng)；進(jìn)而又發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)糖藍(lán)細(xì)菌藻株 (導(dǎo)入并誘導(dǎo)表達(dá)了基因的聚球藻PCC 7942) 的培養(yǎng)體系中，直接接種釀酒酵母，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞所合成并分泌的蔗糖可以維持酵母細(xì)胞生存并進(jìn)行至少兩次分裂[9]。上述研究初步證實(shí)了以藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖體系為基礎(chǔ)，維持人工合成共生體系運(yùn)行的可行性。

3.2 人工光驅(qū)共生合成體系的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用

Ducat實(shí)驗(yàn)室進(jìn)而探索了藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖細(xì)胞工廠與3種經(jīng)典的異養(yǎng)工業(yè)微生物 (大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母) 分別進(jìn)行共培養(yǎng)的可行性[41]。研究結(jié)果表明，以藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖為能量和物質(zhì)基礎(chǔ)的共生體系能夠較為穩(wěn)定地維持?jǐn)?shù)周到數(shù)月的時(shí)間，而且面對(duì)不同的光照強(qiáng)度和光照節(jié)律表現(xiàn)出很強(qiáng)的魯棒性。共培養(yǎng)體系中，異養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)和代謝完全依賴于藍(lán)細(xì)菌合成并分泌的蔗糖，令人驚訝的是異養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)甚至可以反向促進(jìn)藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)糖細(xì)胞的光合固碳和生長(zhǎng)，并因此進(jìn)一步增強(qiáng)了共生系統(tǒng)的穩(wěn)定性和魯棒性。如圖2所示，當(dāng)使用進(jìn)行了代謝工程改造的異養(yǎng)微生物細(xì)胞工廠替代其野生型菌株后，人工合成的光合共生系統(tǒng)還可以支撐高附加值化學(xué)品的生物合成 (枯草芽孢桿菌合成淀粉酶、大腸桿菌合成聚羥基丁酸酯)[41]。

近期，該研究組對(duì)藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖支撐的人工合成共生體系進(jìn)行了優(yōu)化，主要內(nèi)容是使用海藻酸鈉為基質(zhì)對(duì)產(chǎn)糖藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行包覆，這種包覆對(duì)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞的存活和產(chǎn)糖活性影響不大，卻能夠很大程度上限制細(xì)胞的復(fù)制，從而能夠使光合碳流更多定向于蔗糖的合成上，與浮游狀態(tài)的細(xì)胞相比，海藻酸鈉包覆的細(xì)胞蔗糖單位生產(chǎn)效率得到了2–3倍的提高[42]。將海藻酸鈉包覆的藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)糖細(xì)胞與一種天然的PHB合成微生物——玻利維亞鹽單胞菌共培養(yǎng)，所形成的光驅(qū)共生系統(tǒng)對(duì)環(huán)境擾動(dòng)和生物污染表現(xiàn)出極強(qiáng)的抵抗能力，可以在長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的培養(yǎng)時(shí)間中維持整體生物量 (主要是) 和目標(biāo)產(chǎn)品PHB的持續(xù)增長(zhǎng)，在此期間不需要外源添加任何抗生素和其他選擇性策略。此外，與浮游的藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞相比，海藻酸鈉包覆體與細(xì)胞在沉降系數(shù)上差異更大，意味著包含PHB的細(xì)胞生物量可以更便捷地從共生培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行選擇性采集。研究人員還證實(shí)這種海藻酸鈉包覆體同樣可以用于能夠合成PHB的大腸桿菌工程菌株共培養(yǎng)，表明這一策略具有較好的普適性[42]。

圖2 基于藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)的人工合成光驅(qū)共生系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和工作原理

值得注意的是，以現(xiàn)有的藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)為基礎(chǔ)的人工合成光驅(qū)共生合成系統(tǒng)，要求所采用的異養(yǎng)微生物細(xì)胞工廠必須具備蔗糖的利用能力，而對(duì)于天然無(wú)法利用吸收-代謝蔗糖的微生物菌株則需要進(jìn)行針對(duì)性改造。與前面介紹的其他異養(yǎng)微生物相比，具有很強(qiáng)的逆境脅迫耐受能力的惡臭假單胞菌對(duì)產(chǎn)糖藍(lán)細(xì)菌所用的培養(yǎng)基的適應(yīng)性最好，只需要很小的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，非常適合于共培養(yǎng)[43]。但是該菌無(wú)法利用蔗糖，Lowe等為了提高的蔗糖利用能力，向該菌中導(dǎo)入了系統(tǒng)，其中CscA能夠?qū)舛嗵撬鉃槠咸烟呛凸?，而CscB則可以促進(jìn)糖類的吸收，最終構(gòu)建了可以進(jìn)行PHB合成的人工合成光驅(qū)共生系統(tǒng)[43]。

3.3 人工光驅(qū)共生合成體系的概念擴(kuò)展和機(jī)制研究

從設(shè)計(jì)上看，目前大多人工構(gòu)建的光驅(qū)共生系統(tǒng)都是以單向支撐的，完全以藍(lán)細(xì)菌的光驅(qū)固碳合成蔗糖為系統(tǒng)維持運(yùn)行的能量和物質(zhì)供應(yīng)基礎(chǔ)。近期，Smith等設(shè)計(jì)了一種雙向互通式共生系統(tǒng)，利用廣泛應(yīng)用的產(chǎn)糖聚球藻藻株 (導(dǎo)入了的聚球藻PCC 7942) 和一種固碳微生物——棕色固氮菌，人工構(gòu)建了一種新的互利型共生體[44]。在這個(gè)共生體系中，產(chǎn)糖藍(lán)細(xì)菌藻株在鹽脅迫條件下，利用光合作用固碳合成蔗糖并分泌至胞外，提供給棕色固氮菌有機(jī)碳源；而棕色固氮菌則利用蔗糖生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而反向?yàn)楫a(chǎn)糖藍(lán)細(xì)菌提供有機(jī)氮源。與此前報(bào)道的人工光驅(qū)共生體系相比，這種雙向互利式光驅(qū)共生體可以在最基本的營(yíng)養(yǎng)條件下自我維持，不需要額外添加任何有機(jī)氮源和碳源就可以進(jìn)行有價(jià)值的代謝物的合成[44]。

藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖細(xì)胞工廠和合成高附加值化學(xué)品的異養(yǎng)微生物細(xì)胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)，是模擬自然條件下自養(yǎng)-異養(yǎng)生物共生體系而構(gòu)建的人工合成共生模式[45]，實(shí)現(xiàn)從無(wú)機(jī)CO2向高附加值有機(jī)產(chǎn)物的全鏈條轉(zhuǎn)化。與單一平臺(tái)的合成模式相比 (直接在藍(lán)細(xì)菌中構(gòu)建目標(biāo)化學(xué)品的合成途徑)，這種共生系統(tǒng)通過(guò)將具備多樣化代謝和生理特性的不同微生物組分有機(jī)整合，對(duì)復(fù)雜的、涉及大量催化步驟的反應(yīng)途徑造成的代謝和生理負(fù)擔(dān)進(jìn)行分流和緩沖，有利于實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、可持續(xù)的生物合成過(guò)程。雖然理論上，藍(lán)細(xì)菌光合作用固定的碳流中一大部分會(huì)被重新定向于共生的異養(yǎng)微生物生物量的積累，并因此造成可進(jìn)行光合作用的細(xì)胞數(shù)量降低；但這種損失可以通過(guò)共生體系中，異養(yǎng)微生物代謝對(duì)藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)的“反哺”式有利作用來(lái)部分彌補(bǔ)。已有的研究表明，向微藻培養(yǎng)體系中接種來(lái)自其自然生長(zhǎng)環(huán)境中的異養(yǎng)微生物能有效地促進(jìn)微藻細(xì)胞的光合生長(zhǎng)和代謝活性[46-47]；而在人工合成光驅(qū)共生體系的開(kāi)發(fā)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，與異養(yǎng)微生物 (包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和酵母) 的共培養(yǎng)對(duì)藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞光合生長(zhǎng)有顯著的生長(zhǎng)促進(jìn)和脅迫保護(hù)作用[41,45]。關(guān)于這種促進(jìn)和保護(hù)作用具體機(jī)制的解析仍處于探索階段。Li等在研究產(chǎn)蔗糖藍(lán)細(xì)菌和膠紅類酵母菌的共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，藍(lán)細(xì)菌在高密度培養(yǎng)下，其活躍的光合作用會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)體系中大量積累活性氧并導(dǎo)致藍(lán)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制；而共培養(yǎng)的酵母細(xì)胞可以有效清除活性氧，減輕藍(lán)細(xì)菌的生理負(fù)擔(dān)并促進(jìn)其生長(zhǎng)[45]。在未來(lái)，為了實(shí)現(xiàn)光合自養(yǎng)微生物和異養(yǎng)微生物之間的最優(yōu)平衡，需要進(jìn)一步探索設(shè)計(jì)原則和有效調(diào)控方案，從而實(shí)現(xiàn)合成共生體內(nèi)部的代謝互補(bǔ)和互利[48]。

4 總結(jié)和展望

全球范圍內(nèi)，藍(lán)細(xì)菌通過(guò)高效的光合作用提供了生物圈內(nèi)20%左右的有機(jī)碳源，是極為重要的初級(jí)生產(chǎn)力[49-50]?；诤铣缮飳W(xué)和代謝工程技術(shù)發(fā)展，已經(jīng)可以通過(guò)基因、蛋白、途徑層面上使這一過(guò)程集約化、可控化，以光能為驅(qū)動(dòng)將光合自養(yǎng)細(xì)胞中二氧化碳和水直接轉(zhuǎn)化為含能有機(jī)分子。而光合生物制造技術(shù)的發(fā)展方向則是在此基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)大尺度時(shí)空范圍下，定制化的藍(lán)細(xì)菌和微藻細(xì)胞群體中，能量和物質(zhì)的高效、高通量、定向轉(zhuǎn)化。藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)是一項(xiàng)具有代表性的光合生物制造技術(shù)，也是極具潛力的新型糖原料供應(yīng)路線。相比較于傳統(tǒng)的“植物種植-生物質(zhì)采集-原料預(yù)處理-糖類提取”的路線，“微藻培養(yǎng)-糖類合成”的技術(shù)模式過(guò)程簡(jiǎn)單、產(chǎn)物明確，而且可以依托鹽堿地、灘涂等邊際土地進(jìn)行工程應(yīng)用，既“不與人爭(zhēng)糧”、又“不與糧爭(zhēng)地”，可以同時(shí)達(dá)到固碳減排和促進(jìn)綠色生物經(jīng)濟(jì)模式發(fā)展的效果。以目前的36 mg/(L?h)的蔗糖合成水平計(jì)算，如果在規(guī)?；囵B(yǎng)體系下成功地等效放大，其估算效益可以達(dá)到每公頃土地年產(chǎn)蔗糖55噸的水平，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)同等種植面積的甘蔗的蔗糖生產(chǎn)能力，技術(shù)和模式的發(fā)展前景非?？捎^[9]。然而，要真正推動(dòng)藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖技術(shù)的工程化、規(guī)?；瘧?yīng)用，有待解決的問(wèn)題還很多。

首先，藍(lán)細(xì)菌鹽脅迫響應(yīng)型蔗糖合成的調(diào)控機(jī)制仍不清楚。目前，藍(lán)細(xì)菌蔗糖合成仍依賴于高濃度鹽脅迫，通過(guò)合成生物學(xué)和代謝工程改造來(lái)實(shí)現(xiàn)“非鹽脅迫型”蔗糖合成的設(shè)想尚未實(shí)現(xiàn)。這在一定程度上增加了光驅(qū)固碳產(chǎn)糖技術(shù)的復(fù)雜性和應(yīng)用難度。從遺傳調(diào)控和生理生化角度上，揭示蔗糖合成途徑在“鹽脅迫”/“非鹽脅迫”兩種模式下的活動(dòng)機(jī)制，進(jìn)而重構(gòu)調(diào)控模式，實(shí)現(xiàn)“人工控制信號(hào)”替代“鹽脅迫信號(hào)”進(jìn)行蔗糖合成的誘導(dǎo)，將是簡(jiǎn)化藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖條件、提高該技術(shù)成熟度的重要發(fā)展方向。

其次，藍(lán)細(xì)菌底盤藻株和產(chǎn)糖工程藻株的逆境脅迫耐受性仍有待提高。與實(shí)驗(yàn)室內(nèi)理想而穩(wěn)定的環(huán)境條件相比，微藻規(guī)?；囵B(yǎng)中可能會(huì)遇到高溫、高光、高pH等脅迫因素；而產(chǎn)糖藻株的培養(yǎng)過(guò)程中，分泌到胞外的蔗糖進(jìn)一步增加了生物污染的風(fēng)險(xiǎn)，為了控制、抑制生物污染而采取的各種選擇性策略和條件對(duì)藍(lán)細(xì)菌的魯棒性也提出了更高的要求?，F(xiàn)階段，光驅(qū)固碳產(chǎn)糖細(xì)胞工廠普遍以集胞藻PCC 6803、聚球藻PCC 7942等模式藻株為底盤進(jìn)行開(kāi)發(fā)，其生理魯棒性和適切性難以滿足未來(lái)規(guī)?；囵B(yǎng)環(huán)境的需求。篩選、開(kāi)發(fā)具有更強(qiáng)逆境適應(yīng)能力的底盤藻株，或者系統(tǒng)應(yīng)用合成生物技術(shù)提升現(xiàn)有藻株的逆境適應(yīng)能力，將是下一階段藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)糖細(xì)胞工廠開(kāi)發(fā)所必須考慮的方向[48]。

第三，藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳產(chǎn)糖體系中蔗糖的高效分離和采收技術(shù)研究仍是空白。如前所述，雖然通過(guò)開(kāi)發(fā)人工合成光驅(qū)共生體系等策略可以在一定程度上解決分泌到胞外的蔗糖容易引發(fā)雜菌污染的問(wèn)題，但著眼于未來(lái)更大規(guī)模、更廣范圍的光驅(qū)固碳合成糖類技術(shù)的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，蔗糖為代表的糖類產(chǎn)品如何快速、有效地從培養(yǎng)體系中分離出來(lái)仍然是亟待解決的問(wèn)題，強(qiáng)效的、特異性的樹(shù)脂吸附、膜分離技術(shù)的開(kāi)發(fā)將有望為這一問(wèn)題的解決提供助力。

未來(lái)，通過(guò)系統(tǒng)運(yùn)用合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、過(guò)程工程科學(xué)的策略和手段，深入解析藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)糖的遺傳和代謝機(jī)制，解除太陽(yáng)能驅(qū)動(dòng)下胞內(nèi)物質(zhì)和能量向蔗糖轉(zhuǎn)化的機(jī)制性瓶頸，結(jié)合適配性的工藝和設(shè)備，光驅(qū)固碳產(chǎn)糖技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用必將取得新的突破。

[1] Zhang YP, Zhu Y, Zhu Y, et al. The importance of engineering physiological functionality into microbes. Trends Biotechnol, 2009, 27(12): 664–672.

[2] Dien BS, Cotta MA, Jeffries TW, et al. Bacteria engineered for fuel ethanol production: current status. Appl Microbiol Biotechnol, 2003, 63(3): 258–266.

[3] Rastogi RP, Pandey A, Larroche C, et al. Algal green energy-R & D and technological perspectives for biodiesel production. Renew Sustain Energy Rev, 2018, 82: 2946–2969.

[4] Waterbury JB, Watson SW, Guillard RR, et al. Widespread occurrence of a unicellular, marine, planktonic, cyanobacterium. Nature, 1979, 277(5694): 293–294.

[5] Lu XF. A perspective: photosynthetic production of fatty acid-based biofuels in genetically engineered cyanobacteria. Biotechnol Adv, 2010, 28(6): 742–746.

[6] Melis A. Photosynthesis-to-fuels: from sunlight to hydrogen, isoprene, and botryococcene production. Energ Environ Sci, 2012, 5(2): 5531–5539.

[7] Hays SG, Ducat DC. Engineering cyanobacteria as photosynthetic feedstock factories. Photosynth Res, 2015, 123(3): 285–295.

[8] Hagemann M. Molecular biology of cyanobacterial salt acclimation. FEMS Microbiol Rev, 2011, 35(1): 87–123.

[9] Ducat DC, Avelar-Rivas JA, Way JC, et al. Rerouting carbon flux to enhance photosynthetic productivity. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(8): 2660–2668.

[10] Brown AD, Simpson JR. Water relations of sugar-tolerant yeasts: the role of intracellular polyols. J Gen Microbiol, 1972, 72(3): 589–591.

[11] Mackay MA, Norton RS, Borowitzka LJ. Organic osmoregulatory solutes in cyanobacteria. J Gen Microbiol, 1984, 130: 2177–2191.

[12] Reed RH, Stewart WDP. Osmotic adjustment and organic solute accumulation in unicellular cyanobacteria from freshwater and marine habitats. Mar Biol, 1985, 88(1): 1–9.

[13] Damrow R, Maldener I, Zilliges Y. The multiple functions of common microbial carbon polymers, glycogen and PHB, during stress responses in the non-diazotrophic cyanobacteriumsp. PCC 6803. Front Microbiol, 2016, 7: 966.

[14] Nakamura Y, Takahashi J, Sakurai A, et al. Some cyanobacteria synthesize semi-amylopectin type α-polyglucans instead of glycogen. Plant Cell Physiol, 2005, 46(3): 539–545.

[15] Ball SG, Morell MK. From bacterial glycogen to starch: understanding the biogenesis of the plant starch granule. Annu Rev Plant Biol, 2003, 54: 207–233.

[16] Guerra LT, Xu Y, Bennette N, et al. Natural osmolytes are much less effective substrates than glycogen for catabolic energy production in the marine cyanobacteriumsp. strain PCC 7002. J Biotechnol, 2013, 166(3): 65–75.

[17] Hendry JI, Prasannan C, Ma F, et al. Rerouting of carbon flux in a glycogen mutant of cyanobacteria assessed via isotopically non-stationary13C metabolic flux analysis. Biotechnol Bioeng, 2017, 114(10): 2298–2308.

[18] Curatti L, Porchia AC, Herrera-Estrella L, et al. A prokaryotic sucrose synthase gene () isolated from a filamentous nitrogen-fixing cyanobacterium encodes a protein similar to those of plants. Planta, 2000, 211(5): 729–735.

[19] Porchia AC, Curatti L, Salerno GL. Sucrose metabolism in cyanobacteria: sucrose synthase fromsp. strain PCC 7119 is remarkably different from the plant enzymes with respect to substrate affinity and amino-terminal sequence. Planta, 1999, 210(1): 34–40.

[20] Curatti L, Giarrocco L, Salerno GL. Sucrose synthase and RuBisCo expression is similarly regulated by the nitrogen source in the nitrogen-fixing cyanobacteriumsp. Planta, 2006, 223(5): 891–900.

[21] Kanesaki Y, Suzuki I, Allakhverdiev SI, et al. Salt stress and hyperosmotic stress regulate the expression of different sets of genes insp. PCC 6803. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 290(1): 339–348.

[22] Allakhverdiev SI, Sakamoto A, Nishiyama Y, et al. Inactivation of photosystems I and II in response to osmotic stress incontribution of water channels. Plant Physiol, 2000, 122(4): 1201–1208.

[23] Allakhverdiev SI, Sakamoto A, Nishiyama Y, et al. Ionic and osmotic effects of NaCl-induced inactivation of photosystems I and II insp. Plant Physiol, 2000, 123(3): 1047–1056.

[24] Giner-Lamia J, López-Maury L, Reyes JC, et al. The CopRS two-component system is responsible for resistance to copper in the cyanobacteriumsp. PCC 6803. Plant Physiol, 2012, 159(4): 1806–1818.

[25] Liu ZX, Li HC, Wei YP, et al. Signal transduction pathways insp. PCC 6803 and biotechnological implications under abiotic stress. Crit Rev Biotechnol, 2015, 35(2): 269–280.

[26] Narikawa R, Suzuki F, Yoshihara S, et al. Novel photosensory two-component system (PixA-NixB-NixC) involved in the regulation of positive and negative phototaxis of cyanobacteriumsp. PCC 6803. Plant Cell Physiol, 2011, 52(12): 2214–2224.

[27] Liang CW, Zhang XW, Chi XY, et al. Serine/threonine protein kinase SpkG is a candidate for high salt resistance in the unicellular cyanobacteriumsp. PCC 6803. PLoS ONE, 2011, 6(5): e18718.

[28] Ehira S, Kimura S, Miyazaki S, et al. Sucrose synthesis in the nitrogen-fixing cyanobacteriumsp. strain PCC 7120 is controlled by the two-component response regulator orra. Appl Environ Microbiol, 2014, 80(18): 5672–5679.

[29] Desplats P, Folco E, Salerno GL. Sucrose may play an additional role to that of an osmolyte insp. PCC 6803 salt-shocked cells. Plant Physiol Biochem, 2005, 43(2): 133–138.

[30] Cumino AC, Perez-Cenci M, Giarrocco LE, et al. The proteins involved in sucrose synthesis in the marine cyanobacteriumsp. PCC 7002 are encoded by two genes transcribed from a gene cluster. FEBS Lett, 2010, 584(22): 4655–4660.

[31] Salerno GL, Porchia AC, Vargas WA, et al. Fructose-containing oligosaccharides: novel compatible solutes incells exposed to salt stress. Plant Sci, 2004, 167(5): 1003–1008.

[32] Song K, Tan XM, Liang YJ, et al. The potential ofUTEX 2973 for sugar feedstock production. Appl Microbiol Biotechnol, 2016, 100(18): 7865–7875.

[33] Yu JJ, Liberton M, Cliften PF, et al.UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Sci Rep, 2015, 5: 8132.

[34] Du W, Liang FY, Duan YK, et al. Exploring the photosynthetic production capacity of sucrose by cyanobacteria. Metab Eng, 2013, 19: 17–25.

[35] Qiao CC, Duan YK, Zhang MY, et al. Effects of reduced and enhanced glycogen pools on salt-induced sucrose production in a sucrose-secreting strain ofPCC 7942. Appl Environ Microbiol, 2018, 84(2): e02023–17.

[36] Kirsch F, Luo Q, Lu XF, et al. Inactivation of invertase enhances sucrose production in the cyanobacteriumsp. PCC 6803. Microbiology, 2018, 164(10): 1220–1228.

[37] Zhou J, Zhu TC, Cai Z, et al. From cyanochemicals to cyanofactories: a review and perspective. Microb Cell Fact, 2016, 15: 2.

[38] Xu Y, Guerra LT, Li ZK, et al. Altered carbohydrate metabolism in glycogen synthase mutants ofsp. strain PCC 7002: Cell factories for soluble sugars. Metab Eng, 2013, 16: 56–67.

[39] Abramson BW, Lensmire J, Lin YT, et al. Redirecting carbon to bioproduction via a growth arrest switch in a sucrose-secreting cyanobacterium. Algal Res, 2018, 33: 248–255.

[40] Shabestary K, Anfelt J, Ljungqvist E, et al. Targeted repression of essential genes to arrest growth and increase carbon partitioning and biofuel titers in cyanobacteria. ACS Synth Biol, 2018, 7(7): 1669–1675.

[41] Hays SG, Yan LL, Silver PA, et al. Synthetic photosynthetic consortia define interactions leading to robustness and photoproduction. J Biol Eng, 2017, 11: 4.

[42] Weiss TL, Young EJ, and Ducat DC. A synthetic, light-driven consortium of cyanobacteria and heterotrophic bacteria enables stable polyhydroxybutyrate production. Metab Eng, 2017, 44: 236–245.

[43] L?we H, Hobmeier K, Moos M, et al. Photoautotrophic production of polyhydroxyalkanoates in a synthetic mixed culture ofand. Biotechnol Biof, 2017, 10: 190.

[44] Smith MJ, Francis MB. A Designed–coculture for chemical photoproduction from air, water, phosphate, and trace metals. ACS Synth Biol, 2016, 5(9): 955–961.

[45] Li TT, Li CT, Butler K, et al. Mimicking lichens: incorporation of yeast strains together with sucrose-secreting cyanobacteria improves survival, growth, ROS removal, and lipid production in a stable mutualistic co-culture production platform. Biotechnol Biof, 2017, 10: 55.

[46] Morris JJ, Kirkegaard R, Szul MJ, et al. Facilitation of robust growth ofcolonies and dilute liquid cultures by “helper” heterotrophic bacteria. Appl Environ Microbiol, 2008, 74(14): 4530–4534.

[47] Nascimento MD, De Los Angeles Dublan M, Ortiz-Marquez JCF, et al. High lipid productivity of anartificial consortium. Bioresour Technol, 2013, 146: 400–407.

[48] Luan GD, Lu XF. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnol Adv, 2018, 36(2): 430–442.

[49] Rousseaux CS, Gregg WW. Interannual variation in phytoplankton primary production at a global scale. Remote Sens, 2014, 6(1): 1–19.

[50] Flombaum P, Gallegos JL, Gordillo RA, et al. Present and future global distributions of the marine cyanobacteriaand. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(24): 9824–9829.

Cyanobacteria based photosynthetic production of sucrose: development and prospect

Xintong Chi1,2, Shanshan Zhang2, Shaoming Mao1, Guodong Luan2, Quan Luo2, and Xuefeng Lü2

1 College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China 2 Key Laboratory of Biofuels, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, Shandong, China

Biorefinery technologies provide promising solutions to achieve sustainable development facing energy and environment crisis, while abundant sugar feedstock is an essential basis for biorefinery industries. Photosynthetic production of sucrose with cyanobacteria is an alternative sugar feedstock supply route with great potentials. Driven by solar energy, cyanobacteria photosynthetic cell factory could directly convert carbon dioxide and water into sucrose, and such a process could simultaneously reduce carbon emissions and supply sugar feedstocks. Here we introduced the history and updated the state-of-the-art on development of cyanobacteria cell factories for photosynthetic production of sucrose, summarized the progress and problems on mechanisms of sucrose synthesis, metabolic engineering strategies and technology expansions, and finally forecasted the future development direction in this area.

cyanobacteria, sucrose, photosynthesis, metabolic engineering, salt stress

January 14, 2019;

January 31, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31600034, 31770092), Key Scientific Research Projects of Education Department of Hunan Province (No. 15A198).

Shaoming Mao. Tel: +86-731-85623497, E-mail: msm526@163.com Guodong Luan. Tel: +86-532-80662711, Email: luangd@qibebt.ac.cn.

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31600034, 31770092)，湖南省教育廳科研重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 15A198) 資助。

2019-06-20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190620.1123.001.html

郗欣彤, 張杉杉, 毛紹名, 等. 藍(lán)細(xì)菌光驅(qū)固碳合成蔗糖技術(shù)的發(fā)展與展望. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1411–1423.Chi XT, Zhang SS, Mao SM, et al. Cyanobacteria based photosynthetic production of sucrose: development and prospect. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1411–1423.

(本文責(zé)編 郝麗芳)