基因敲除技術(shù)及其在研究線粒體動(dòng)力學(xué)與胰島素抵抗關(guān)系中的應(yīng)用進(jìn)展

徐佳，關(guān)越琪，于芷懿，張成帥，關(guān)鳳英，劉芬

基因敲除技術(shù)及其在研究線粒體動(dòng)力學(xué)與胰島素抵抗關(guān)系中的應(yīng)用進(jìn)展

徐佳1，關(guān)越琪1，于芷懿1，張成帥2，關(guān)鳳英1，劉芬1

1 吉林大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021 2 吉林大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，吉林 長春 130021

線粒體動(dòng)力學(xué)即線粒體融合和分裂保持動(dòng)態(tài)平衡的過程，該過程由融合/分裂相關(guān)蛋白精確調(diào)控完成，對于線粒體代謝、質(zhì)量和功能有著重要的生理意義，而這些蛋白發(fā)生異?？梢l(fā)線粒體動(dòng)力學(xué)失衡，進(jìn)而引起線粒體功能障礙并引發(fā)各種疾病狀態(tài)。文中圍繞基因敲除技術(shù)，詳細(xì)闡述了編碼融合/分裂相關(guān)蛋白的基因敲除鼠在胰島素抵抗研究工作中的作用及應(yīng)用進(jìn)展，以期為今后研究線粒體動(dòng)力學(xué)失衡致胰島素抵抗的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

基因敲除技術(shù)，線粒體動(dòng)力學(xué)，胰島素抵抗

基因敲除在20世紀(jì)80年代后期出現(xiàn)，是指通過特定的措施使生物體內(nèi)特定的基因失活或缺失的基因重組技術(shù)。一般而言，基因敲除是依據(jù)DNA同源重組的原理，用設(shè)計(jì)的同源序列替換靶基因序列進(jìn)而達(dá)到敲除的目的[1]。

近20年來，隨著對分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的需求不斷加強(qiáng)，位點(diǎn)特異性重組 (Site-specific recombination) 技術(shù)的發(fā)展也日漸興盛，它是目前基因敲除技術(shù)中應(yīng)用最方便和廣泛的一項(xiàng)技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)利用位點(diǎn)特異性重組酶 (Site-specific recombinase，SSR) 對特異性位點(diǎn) (Secombination target site，RTS) 識別，在基因組上完成外源基因的倒置、置換和刪除等操作，具有重組效率高、靶向性好、操作簡單、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)[2]，目前廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域，主要通過干預(yù)目的基因進(jìn)行相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制及治療的研究[3]。本文擬從基因敲除技術(shù)的發(fā)展、線粒體動(dòng)力學(xué)與胰島素抵抗關(guān)系的研究進(jìn)展及基因敲除鼠在胰島素抵抗中的研究進(jìn)展三方面進(jìn)行綜述。

1 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中的發(fā)展

位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)通常由SSR及RTS兩種組分構(gòu)成。在研究比較成熟的SSR系統(tǒng)中，按照SSR序列的同源性可分成兩個(gè)家族：酪氨酸家族和絲氨酸家族。其中來自酪氨酸家族的Cre/lox P、FLP/FRT和Dre/Rox是目前研究最深入應(yīng)用最廣泛的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)[4]。

1.1 Cre/lox P系統(tǒng)

Cre (Causes recombination) 重組酶于1981年從P1噬菌體中發(fā)現(xiàn)，編碼由343個(gè)氨基酸組成的38 kDa單體蛋白[5]。它具備一定的催化活性，并且類似于限制性核酸內(nèi)切酶，識別的特異性位點(diǎn)稱為lox P，能同時(shí)使2個(gè)lox P位點(diǎn)間的基因特異性缺失。lox P的長度為34 bp，由2個(gè)13 bp的反向回文序列和1個(gè)8 bp核心序列組成。Cre重組酶具有高達(dá)70%的重組效率，并且可作用于各種結(jié)構(gòu)的DNA底物 (如環(huán)狀、線性甚至超螺旋DNA) 而不需要額外的重組輔助因子[6]，因此它被公認(rèn)為是基因組工程的最佳SSR。目前正在研究和開發(fā)各種類型的Cre，例如與熒光分子融合的熒光Cre、經(jīng)過優(yōu)化的高表達(dá)Cre和在N-末端和C-末端具有不同啟動(dòng)子的Cre。1998年Sauer和Henderson創(chuàng)建了表達(dá)Cre的小鼠細(xì)胞系，并提示由Cre介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組發(fā)生在小鼠體內(nèi)，表明原核Cre/lox P系統(tǒng)可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中起作用，是一種強(qiáng)大的哺乳動(dòng)物基因編輯技術(shù)[7]。

這一系統(tǒng)操作非常簡單，在待敲除的一段目的基因序列的側(cè)翼各設(shè)置1個(gè)lox P序列，經(jīng)過Cre的切除得到Flox P (Flanked by lox P) 小鼠。當(dāng)Flox P小鼠在與表達(dá)Cre的小鼠雜交時(shí)，目的基因正常表達(dá)，從而避免全基因敲除期間可能發(fā)生的嚴(yán)重發(fā)育缺陷或胚胎致死。為了實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的基因敲除，可將Cre基因置于誘導(dǎo)型啟動(dòng)子或增強(qiáng)子控制下，通過誘導(dǎo)Cre重組酶的表達(dá)來敲除2個(gè)lox P位點(diǎn)間的靶基因，使目的基因在小鼠發(fā)育的特定階段和特定組織中失活，而該基因在其他組織中正常表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對目的基因時(shí)間和空間的雙重調(diào)控[8-9]，目前的誘導(dǎo)型Cre重組酶系統(tǒng)主要有他莫昔芬 (TAM) 和四環(huán)素 (TET)。

Cre/lox P系統(tǒng)普遍應(yīng)用于各種生物的遺傳重組。Wesam等[10]使用Cre/lox P系統(tǒng)產(chǎn)生了條件性白細(xì)胞介素-1受體1 (IL-1R1) 小鼠突變體；Yuki等[11]應(yīng)用Cre/lox P系統(tǒng)第一次構(gòu)建出萊茵衣藻無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因菌株。Chen等[12]通過組合使用CRISPR/Cas9和Cre/lox P系統(tǒng)在秀麗隱桿線蟲中進(jìn)行了靶向染色體重排。

敲除效率是Cre/lox P系統(tǒng)特異性敲除的一個(gè)重要問題。效率由幾個(gè)因素決定，包括Cre重組酶的活性、Flox P的性質(zhì)以及Flox P在細(xì)胞增殖或存活中的功能。組織特異性Cre的表達(dá)水平由調(diào)控元件的活性所限制，而調(diào)控元件也控制內(nèi)源性特異性基因。如果Cre表達(dá)水平不足以介導(dǎo)重組，則可以在構(gòu)建載體的過程中修飾這些調(diào)節(jié)元件 (例如去除沉默子)，然而這些修飾也可能導(dǎo)致Cre表達(dá)中組織或細(xì)胞特異性喪失。人源化Cre (hCre或iCre) 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表現(xiàn)出比常規(guī)Cre更高的活性，已被用于提高敲除效率[13]。另一個(gè)需要注意的問題是當(dāng)Cre高水平表達(dá)時(shí)，Cre具有細(xì)胞毒性[14]。為了最小化Cre毒性，最好以誘導(dǎo)方式控制Cre的表達(dá)或活性，或者誘導(dǎo)Cre自身失活，即Cre基因側(cè)翼各放置一個(gè)lox P位點(diǎn)。

1.2 FLP/FRT系統(tǒng)

1980年Hartley等對釀酒酵母的2 μm雙鏈環(huán)狀DNA質(zhì)粒的序列進(jìn)行了測序，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)上存在2個(gè)599 bp的反向重復(fù)序列[15]。這兩個(gè)重復(fù)序列之間能重組的特性，使酵母中2 μm環(huán)狀質(zhì)粒存在兩種不同的構(gòu)型[16-18]。經(jīng)過更深入的研究，發(fā)現(xiàn)在2 μm環(huán)狀質(zhì)粒內(nèi)發(fā)生的DNA重組屬于位點(diǎn)特異性重組。Broach等將催化這一重組反應(yīng)的重組酶命名為“FLP” (Flippase recombination enzyme)[19]。

FLP的特異性識別序列FRT長度為48 bp，包含3個(gè)13 bp的重復(fù)序列和1個(gè)8 bp的非對稱間隔區(qū)[20-21]。其中2個(gè)13 bp的重復(fù)序列與8 bp間隔區(qū)相鄰，同時(shí)也是重組酶識別和結(jié)合的位點(diǎn)，而FLP介導(dǎo)的DNA鏈斷裂、倒置、重接等重組過程都發(fā)生在8 bp間隔區(qū)[22]。FLP/FRT系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于微生物和高等真核生物，如大腸桿菌、絲狀真菌、玉米、秀麗隱桿線蟲、蠶、小鼠等[23-26]。

Cre和FLP重組酶都屬于酪氨酸位點(diǎn)SSR，但是FLP介導(dǎo)的基因敲除效率較低。后來意識到FLP的效率之所以低于Cre，是因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞的最適溫度不合適。FLP重組酶的最適反應(yīng)溫度是30 ℃，而不是一般細(xì)胞培養(yǎng)所需要的37 ℃[27]。因此，開發(fā)了增強(qiáng)形式的FLP——FLPe和FLPo，這使FLPe/FRT系統(tǒng)替代了Cre/lox P系統(tǒng)。Raymond等[28]的研究表明，F(xiàn)LPe和FLPo在小鼠ES細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中的重組效率達(dá)到了Cre重組酶的水平。如今，Cre/lox P和FLPe/FRT系統(tǒng)經(jīng)常組合使用來制備靶向重組體，F(xiàn)LPe/FRT系統(tǒng)負(fù)責(zé)去除標(biāo)記物，而Cre/lox P系統(tǒng)負(fù)責(zé)DNA片段的研究。國際基因敲除小鼠協(xié)會 (The international knockout mouse consortium, IKMC) 經(jīng)常利用這種組合策略來生產(chǎn)新的基因敲除小鼠系。

1.3 Dre/Rox系統(tǒng)

Cre重組酶的毒性以及FLP的較弱特性使尋找新的SSR工具迫在眉睫。因此，最近出現(xiàn)了Cre樣SSR——Dre，經(jīng)研究它是一種與Cre同樣出色的重組酶。Dre在腸桿菌噬菌體D6的研究中被確定為Cre樣酶，特異的識別位點(diǎn)是Rox[29]。

在大腸桿菌和中國倉鼠卵巢細(xì)胞中測試了Dre/Rox系統(tǒng)，結(jié)果良好[30]。Anastassiadis等[31]在小鼠中已經(jīng)成功應(yīng)用了Dre/Rox系統(tǒng)。Joon等[32]提出的重組作為一種新的有效的方法，可用于斑馬魚時(shí)間和空間的雙重調(diào)節(jié)。

Dre/Rox的進(jìn)一步應(yīng)用包括基因組工程，如染色體易位、重組[33]。目前Dre/Rox系統(tǒng)研究較少，期待未來有關(guān)Dre/Rox系統(tǒng)的更多研究，為基因敲除技術(shù)的發(fā)展增添新的生機(jī)。

1.4 小結(jié)

位點(diǎn)特異性重組不僅可以避免傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)導(dǎo)致的嚴(yán)重發(fā)育不足和胚胎致死，還可以對目的基因的表達(dá)從時(shí)空兩方面進(jìn)行調(diào)控。其中Cre/lox P系統(tǒng)和FLP/FRT系統(tǒng)由于重組效率較高、操作簡單，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種生物的基因重組特別是高等真核生物的研究中，實(shí)現(xiàn)了各種常規(guī)技術(shù)難以實(shí)施的操作，如基因敲除、點(diǎn)突變、染色體易位、染色體組的大片段刪除等[34]。三種系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)比較如表1所示。

2 線粒體動(dòng)力學(xué)與胰島素抵抗關(guān)系研究進(jìn)展

胰島素抵抗 (Insulin resistance，IR) 是指靶組織在正常的血漿胰島素水平無法發(fā)揮正常降糖作用而產(chǎn)生的病理變化及臨床表現(xiàn)[35]。IR被公認(rèn)為是糖尿病、高血壓、高血脂、肥胖和動(dòng)脈硬化等代謝性疾病的共同土壤，同時(shí)，也是2型糖尿病及各種并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。人類前瞻性研究認(rèn)為IR是未來診斷2型糖尿病最好的預(yù)測指標(biāo)[36]。而最新研究發(fā)現(xiàn)IR與線粒體動(dòng)力學(xué)失衡密切相關(guān)，但兩者之間的因果關(guān)系尚不明晰。

2.1 線粒體動(dòng)力學(xué)

線粒體的形態(tài)并不是一成不變的，相反在不同的生理?xiàng)l件下，線粒體經(jīng)歷高度動(dòng)態(tài)變化以適應(yīng)細(xì)胞能量需求。通過線粒體融合和裂變的連續(xù)循環(huán)發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)線粒體充分均勻分布，維持其網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)平衡，稱為線粒體動(dòng)力學(xué)(Mitochondrial dynamics)。線粒體融合/分裂周期可以平衡線粒體的生物能量、減少輕微受損的線粒體、去除嚴(yán)重受損的線粒體[37]。融合和裂變過程對于維持正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要，例如線粒體呼吸活動(dòng)、線粒體DNA (mtDNA) 分布、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞存活和鈣信號傳導(dǎo)，而該過程由融合/分裂相關(guān)蛋白精確調(diào)控。

目前發(fā)現(xiàn)參與哺乳動(dòng)物線粒體動(dòng)力學(xué)的GTPase家族成員蛋白有：線粒體融合執(zhí)行分子，包括定位于內(nèi)膜的optic atrophy 1 (Opa1) 和定位于外膜的Mitofusin 1/2 (Mfn1/2)，兩個(gè)線粒體融合時(shí)，首先尋找合適的平面進(jìn)行外膜的融合，該過程由Mfn1/2介導(dǎo)，然后在Opa1的介導(dǎo)下進(jìn)行內(nèi)膜的融合，同時(shí)Opa1參與維持線粒體的嵴結(jié)構(gòu)；線粒體分裂執(zhí)行分子，包括跨膜蛋白fission protein 1 (Fis1)、胞質(zhì)中的dynamin-related protein 1 (Drp1) 和介導(dǎo)Drp1募集的外膜蛋白mitochondrial fission factor (Mff)，線粒體分裂時(shí)，Drp1組裝成環(huán)狀結(jié)構(gòu)以GTP依賴性方式收縮線粒體膜，而Fis1錨定于外膜使線粒體分裂。線粒體分裂因子49 kDa (MiD49) 和51 kDa (MiD51) 還可以在沒有Fis1和Mff的情況下介導(dǎo)裂變[38]。線粒體融合分裂過程見圖1。線粒體融合被認(rèn)為是有益的，因?yàn)樗c線粒體功能和ATP的產(chǎn)生增加有關(guān)。相反，過度的線粒體分裂是有害的，因?yàn)樗绊懢€粒體功能并使ROS增加[39]?？傊€粒體動(dòng)力學(xué)是調(diào)節(jié)線粒體功能和形態(tài)的主要方式，對正常的生命活動(dòng)具有非常重要的生理意義，而上述融合/分裂關(guān)鍵蛋白發(fā)生異常即可引發(fā)線粒體動(dòng)力學(xué)失衡，進(jìn)而誘發(fā)各種疾病狀態(tài)。

2.2 線粒體動(dòng)力學(xué)失衡與胰島素抵抗的關(guān)系

雖然有很多類型的體細(xì)胞表達(dá)胰島素受體，但是肝臟、骨骼肌和白色脂肪組織是胰島素產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)的主要器官，在能量代謝中直接發(fā)揮作用，與葡萄糖穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，因此IR也主要在這3種組織中發(fā)生。

肝臟是機(jī)體能量代謝的樞紐，在糖脂代謝中發(fā)揮著決定性作用。作用于肝臟的胰島素是其他組織的2–3倍，而胰島素能快速有效地降低肝臟葡萄糖輸出 (Hepatic glucose production，HGP)，因此肝胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制的重要因素。IR狀態(tài)下，胰島素抑制HGP的能力顯著下降，表現(xiàn)為肝糖異生和糖原分解增加，從而使肝葡萄糖輸出增多，進(jìn)一步加重高血糖。目前已有證據(jù)顯示，在肥胖的db/db小鼠存在著肝細(xì)胞ATP水平下降、線粒體功能紊亂、肝臟線粒體呼吸作用和脂肪酸氧化能力減弱的表型。而蛋白表達(dá)方面，介導(dǎo)線粒體分裂的Drp1有不同程度的增多，而介導(dǎo)線粒體融合的Mfn2表達(dá)降低了45%[40]。

表1 三種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的比較

圖1 線粒體融合/分裂的調(diào)控過程

骨骼肌是一種耗能的組織，它負(fù)責(zé)高達(dá)80%的胰島素作用下的葡萄糖消耗[41]，IR狀態(tài)下，骨骼肌對葡萄糖的攝取和利用降低，肌糖原生成減少。在胰島素抵抗患者的肌肉活檢中發(fā)現(xiàn)，線粒體呼吸鏈生物氧化能力下降，同時(shí)電鏡觀察到線粒體密度和數(shù)目明顯降低，提示骨骼肌在IR狀態(tài)下線粒體動(dòng)力學(xué)失衡[42]。電鏡觀察Zucker大鼠骨骼肌細(xì)胞顯示線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)降低了近25%，且融合執(zhí)行分子Mfn2表達(dá)水平顯著下降[43]。Jheng等[44]發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞可以增加線粒體分裂蛋白Drp1和Fis1的表達(dá)，促進(jìn)氧化應(yīng)激，減少ATP生成，抑制胰島素刺激下的葡萄糖攝取和利用。

脂肪組織是一個(gè)巨大的內(nèi)分泌器官，它分泌多種脂肪因子如脂聯(lián)素、瘦素和TNF-α，以調(diào)節(jié)其他組織如肝臟和肌肉中的葡萄糖代謝，進(jìn)而維持葡萄糖的體內(nèi)平衡，而且它對胰島素非常敏感。在IR狀態(tài)下，胰島素抑制脂肪分解作用減弱，從而使血液中的游離脂肪酸増多[45]。Chun等[46]發(fā)現(xiàn)用高濃度的游離脂肪酸處理已分化的3T3-L1脂肪細(xì)胞，線粒體分裂蛋白Drp1表達(dá)升高，而線粒體融合蛋白Mfn2表達(dá)下降。Li等[47]報(bào)道二甲雙胍和白藜蘆醇通過抑制Drp1的活性來保護(hù)線粒體完整性，并通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激阻止了NLRP3炎性體激活，從而保護(hù)脂肪組織免受高葡萄糖損傷。

以上研究發(fā)現(xiàn)線粒體動(dòng)力學(xué)失衡即線粒體融合/分裂蛋白異常與IR密切相關(guān)，為進(jìn)一步研究線粒體動(dòng)力學(xué)失衡與IR的因果關(guān)系，編碼融合/分裂相關(guān)蛋白的基因敲除鼠被大量應(yīng)用于相關(guān)研究當(dāng)中。

3 基因敲除鼠在研究線粒體動(dòng)力學(xué)與胰島素抵抗關(guān)系中的應(yīng)用

3.1 肝臟特異性敲除drp1 (drp1LKO) 小鼠

LKO (-Liver-KO) 小鼠是lox P/lox P小鼠和Alb-Cre小鼠雜交產(chǎn)生的。

高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)，與對照小鼠相比，LKO小鼠的肝臟和附睪白色脂肪重量減少，胰島素敏感性升高、葡萄糖耐量顯著改善，但血漿胰島素水平?jīng)]有顯著差異。分析糖酵解關(guān)鍵酶 (丙酮酸激酶[PK1]、葡萄糖激酶[GCK])、糖異生關(guān)鍵酶 (磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶[PEPCK]、葡萄糖-6-羧酸酶[G6pase]) 和過氧化物酶體增殖激活受體γ共激活因子1α (PGC-1α) 的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)GCK、G6pase和PGC-1α在禁食的LKO小鼠的肝臟中顯著下調(diào)[48]。顯示肝臟特異性敲除可以抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，故可能是干預(yù)代謝性疾病如肥胖癥和糖尿病的潛在靶點(diǎn)。

3.2 肝臟特異性敲除mfn1 (mfn1LKO) 小鼠

LKO小鼠是lox P/lox P小鼠與白蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)Cre重組酶的C57BL/6小鼠雜交產(chǎn)生的。經(jīng)過Western blotting驗(yàn)證，LKO小鼠肝臟中Mfn1表達(dá)完全消失。肝臟中MFN1表達(dá)的缺失伴隨著Mfn2和線粒體動(dòng)力學(xué)其他蛋白的補(bǔ)償性增加，例如Opa1、Drp1和MFF，這提示肝臟線粒體動(dòng)力學(xué)的改變。肝臟中的Mfn1缺乏導(dǎo)致優(yōu)先使用脂質(zhì)作為能量來源且線粒體生物合成增加。在高脂飲食條件下，相比于對照小鼠，LKO小鼠表現(xiàn)出較低的空腹血糖及顯著降低的循環(huán)胰島素水平，且保持更高的胰島素敏感性。這可能與高脂飲食喂養(yǎng)時(shí)LKO小鼠中TCA活性較高和氧化磷酸化水平偶聯(lián)作用更強(qiáng)有關(guān)，從而防止可能損害胰島素作用的?；鈮A類的積累。此外，LKO小鼠經(jīng)二甲雙胍處理后肝臟顯示出高AMPK活化，與對照小鼠相比降血糖作用更為明顯[49]。故降低Mfn1水平可提供一種新的治療2型糖尿病的策略，以改善二甲雙胍耐藥人群對藥物的敏感性。

3.3 肝臟特異性敲除mfn2 (mfn2LKO) 小鼠

LKO小鼠是由lox P/lox P小鼠和Alb-Cre小鼠雜交產(chǎn)生。在高脂飲食條件下，LKO小鼠肝臟葡萄糖分泌增多，葡萄糖耐量受損，血漿胰島素水平升高，出現(xiàn)IR。LKO小鼠的葡萄糖耐量損傷是由糖異生所導(dǎo)致的肝葡萄糖升高和糖異生關(guān)鍵酶 (丙酮酸羧化酶[PC]、G6pase、PEPCK) 的編碼基因的表達(dá)升高造成的[50]。

3.4 褐色脂肪組織特異性敲除mfn2 (BAT- mfn2-KO) 小鼠

BAT--KO小鼠是lox P/lox P小鼠和Ucp1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠雜交而產(chǎn)生的。

BAT中的缺失使BAT中脂質(zhì)增加，但高脂飲食喂養(yǎng)的BAT--KO小鼠與對照小鼠相比空腹血糖水平和肝脂肪變性沒有顯著性差異，然而胰島素敏感性得到改善，葡萄糖耐量降低，并且BAT的糖酵解能力也升高[51]。

3.5 非特異性敲除mfn2 (mfn2-KO) 小鼠

-KO小鼠是lox P/lox P小鼠與MEF2C啟動(dòng)子控制下表達(dá)Cre重組酶 (MEF2C-73K-Cre) 的小鼠品系雜交，產(chǎn)生-KO小鼠。

在骨骼肌、心臟和大腦中，-KO的MFN2蛋白表達(dá)減少了80%，在脂肪組織、腎臟和肝臟中表達(dá)減少了近50%。免疫熒光分析表明，-KO小鼠的肌肉纖維中，Mfn2明顯減少。此外，-KO小鼠的骨骼肌表現(xiàn)為線粒體分裂增加。

高脂飲食喂養(yǎng)的-KO小鼠與對照組相比葡萄糖耐量受損、血漿胰島素水平升高，產(chǎn)生IR，但胰島素敏感性并沒有顯著性差異。敲除后損害了肝臟、骨骼肌的胰島素信號通路；另外肝臟和肌肉中線粒體功能紊亂、過氧化氫濃度增高[50]。以上融合/分裂基因敲除小鼠與IR關(guān)系總結(jié)如表2所示。

表2 融合/分裂基因敲除小鼠與IR關(guān)系

4 結(jié)語與展望

筆者課題組綜述報(bào)道融合/分裂的關(guān)鍵蛋白異常引起的線粒體動(dòng)力學(xué)失衡與糖尿病外周胰島素抵抗密切相關(guān)，但線粒體動(dòng)力學(xué)失衡究竟是胰島素抵抗的起因還是結(jié)果尚有待深入探究[52]。本文綜述線粒體融合/分裂相關(guān)基因敲除鼠研究結(jié)果表明，肝臟特異性敲除、可使胰島素的敏感性升高，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖；全身非特異性或肝臟特異性敲除可引發(fā)IR，但褐色脂肪組織特異性敲除卻可以改善IR；筆者課題組未發(fā)表的數(shù)據(jù)顯示，對Opa1進(jìn)行沉默干擾，線粒體復(fù)合物Ⅰ的表達(dá)下降，分裂蛋白Drp1的表達(dá)上升，糖異生關(guān)鍵酶PEPCK表達(dá)上升，誘發(fā)肝胰島素抵抗。這些結(jié)果說明融合/分裂基因敲除鼠的基因缺陷特異性與靶組織的選擇性均會對機(jī)體產(chǎn)生不同的影響，對于研究線粒體動(dòng)力學(xué)與胰島素抵抗相互關(guān)系具有非常重要的價(jià)值，也為糖尿病及肥胖癥的發(fā)病機(jī)制與藥物治療的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究提供了穩(wěn)定、可靠的模型。筆者課題組長期從事糖尿病研究，先后報(bào)道了人參皂苷Compound K可通過激活A(yù)MPK改善高脂聯(lián)合STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的肝糖異生[53]；MiR-27a通過直接抑制PPARγ刺激巨噬細(xì)胞浸潤和極化來調(diào)節(jié)高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠的胰島素抵抗[54]；通過2型糖尿病大鼠模型發(fā)現(xiàn)H6PDH與11β-HSD1之間的相互作用與2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[55]。后續(xù)利用融合/分裂相關(guān)基因敲除動(dòng)物模型對上述信號傳導(dǎo)通路的研究將進(jìn)一步揭示胰島素抵抗的分子機(jī)制，為糖尿病胰島素抵抗的研究提供了可靠的工具和潛在方向。以上基因敲除小鼠所使用的皆為Cre/lox P系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)不僅能有效地克服外源基因在染色體中隨機(jī)整合所帶來的不確定性，縮短模型動(dòng)物建立的時(shí)間，還可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因在時(shí)間和空間上的精確表達(dá)調(diào)控，為研究類似IR等代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制及治療提供了一種全新的手段，而其他的基因敲除技術(shù)也有待新的發(fā)掘與發(fā)展。

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Gene knockout technology and its application in the study of the relationship between mitochondrial dynamics and insulin resistance

Jia Xu1, Yueqi Guan1, Zhiyi Yu1, Chengshuai Zhang2, Fengying Guan1, and Fen Liu1

1 College of Basic Medical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China 2 College of Clinical Sciences, Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China

Mitochondrial dynamics, the processes of mitochondrial fusion and fission maintain homeostasis, are precisely regulated by fusion/fission-related proteins, and play an important physiological role in mitochondrial metabolism, quality and function. The aberrant changes of these proteins can trigger mitochondrial dynamics imbalance, which cause mitochondrial dysfunctions and result various disease states. This article focuses on gene knockout technology, and reviews the role and application progress of genes encoding for fusion and fission knockout mice in insulin resistance researches, in order to lay a foundation for future studies on signal transduction mechanism of mitochondrial dynamics imbalance in insulin resistance.

gene knockout technology, mitochondrial dynamics, insulin resistance

April 3, 2019;

June 10, 2019

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81503122).

Fen Liu. Tel: +86-431-85619754; E-mail: liufen@jlu.edu.cn

國家自然科學(xué)基金 (No. 81503122) 資助。

2019-06-27

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20190627.1023.001.html

徐佳, 關(guān)越琪, 于芷懿, 等. 基因敲除技術(shù)及其在研究線粒體動(dòng)力學(xué)與胰島素抵抗關(guān)系中的應(yīng)用進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(8): 1382–1390.Xu J, Guan YQ, Yu ZY, et al. Gene knockout technology and its application in the study of the relationship between mitochondrial dynamics and insulin resistance. Chin J Biotech, 2019, 35(8): 1382–1390.

(本文責(zé)編 陳宏宇)