趨化因子γ干擾素誘導(dǎo)蛋白-10和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3a在肝癌患者外周血中的表達(dá)及診斷價(jià)值

劉娜 張長庚 李偉 孫巨勇

衡水市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（河北衡水 053000）

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是 我國常見的惡性腫瘤之一。近年來外科手術(shù)、介入栓塞及靶向治療等治療手段在肝癌治療中取得良好的臨床效果[1]。但肝癌患者缺乏特異性的癥狀和體征，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已是中晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會(huì)。甲胎蛋白（AFP）是目前診斷HCC的主要血清學(xué)指標(biāo)，但其敏感性不理想，約有1/3早期肝癌AFP陰性，因此有必要深入研究肝癌的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，尋找早期診斷肝癌的血清腫瘤標(biāo)志物[2]。

巨噬細(xì)胞炎性蛋白-3a（macrophage inflammatory protein-3 alpha，MIP-3a），也稱CCL20，表達(dá)于巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞等多種細(xì)胞，對T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞均有趨化作用，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用[3]。γ干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-inducible protein-10，IP-10）又稱CXCL10，與配體CXCR3相互作用，參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、血管生成及腫瘤免疫等。目前MIP-3a、IP-10在肝癌患者血清中的表達(dá)及其臨床意義的研究報(bào)道較少。本研究將通過分析MIP-3a及IP-10在肝癌患者血清中的表達(dá)，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集自2017年10月至2018年10月間于我院診治的118例乙肝相關(guān)肝細(xì)胞癌患者作為HCC組。其中男78例，女40例；年齡39～72歲，平均年齡（45.1±6.5）歲。腫瘤大小：＜3 cm者69例，≥3 cm者49例。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期65例、Ⅲ～Ⅳ期53例。腫瘤分化：高分化22例，中分化63例，低分化33例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有HCC患者均符合2015年版《原發(fā)性肝癌規(guī)范化病理診斷指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。（2）患者慢性乙型肝炎診斷符合2015年版《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。（3）所有患者均為首次診治，未接受過其它治療。（4）除外乙肝病毒陰性的HCC及甲型肝炎、丙肝肝炎患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并急性細(xì)菌性感染、HIV感染及結(jié)核桿菌感染。（2）梅毒密螺旋體抗體陽性。（3）合并自身免疫性疾病。

100例乙肝肝硬化（liver cirrhosis，LC）患者作為LC組，該組男67例，女33例，年齡35～78歲，平均年齡（42.1±6.1）歲。100例慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者作為CHB組，該組男71例，女29例，年齡34～74歲，平均年齡（44.0± 7.3）歲。

100例健康體檢人員作為健康對照組，該組男69例，女31例，年齡33～72歲，平均年齡（41.0±6.8）歲。各組性別、年齡之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核通過，所有患者及家屬均知情同意并已簽署知情同意書。

1.2 研究方法HCC組、LC組、CHB組于復(fù)診時(shí)或入院后、對照組健康體檢者于當(dāng)天清晨采集空腹12 h靜脈血3 mL置于EDTA抗凝管中，室溫下靜置2 h，2 000 r/min離心10 min，血清分離后吸取上層血清置于EP管中保存，保存在-80℃冰箱中待測。通過液相芯片技術(shù)（Luminex）對各組對象外周血趨化因子MIP-3a、IP-10水平測定。儀器為Bio-Plex 200（美國Bio-Rad公司），趨化因子MIP-3a、IP-10磁珠檢測試劑盒由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照相關(guān)說明書操作。血清病毒學(xué)指標(biāo)及血清AFP檢測采用電化學(xué)發(fā)光法檢測，檢測儀器為Cobase601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，乙肝病毒標(biāo)志物試劑盒及AFP試劑盒購自Roche公司。AFP臨界值為20 ng/mL，AFP＞20 ng/mL為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用行單因素方差分析，組間差異差異比較采用Dunnet檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清趨化因子IP-10和MIP-3a的表達(dá)比較HCC組、LC組、CHB組患者血清MIP-3a平均含量分別為（40.14±8.75）、（18.01±4.53）、（14.43± 3.56），（3.22 ± 1.15）pg/mL，HCC組血清MIP-3a含量顯著高于LC組、CHB組及健康對照組（P＜0.05），LC組、CHB組顯著高于健康對照組（P＜0.05），而LC組與CHB組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.647）。

HCC組、LC組、CHB組及健康對照組血清IP-10平均含量分別為（132.23±18.54）、（68.01±15.73）、（64.62 ± 11.19）、（30.71 ± 7.15）pg/mL，HCC組血清IP-10顯著高于LC組、CHB組及健康對照組（P＜0.05），而LC組、CHB組顯著高于健康對照組（P＜0.05），而LC組與CHB組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.501）。見圖1。

圖1 HCC組、LC組、CHB組及健康對照組血清IP-10及MIP-3a水平比較Fig.1 Comparison of serum IP-10 and MIP-3a levels in HCC group，LC group，CHB group and healthy control group

2.2 HCC組患者血清IP-10和MIP-3a的表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系HCC組患者血清IP-10和MIP-3a的表達(dá)水平與腫瘤TNM分期、腫瘤分化以及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而在性別、年齡、腫瘤大小及血清AFP水平之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 ROC曲線分析血清趨化因子IP-10、MIP-3a及AFP對肝癌的診斷價(jià)值血清趨化因子IP-10、MIP-3a及AFP的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.832、0.734、0.772，而 IP-10、MIP-3a聯(lián)合診斷的AUC為0.920，見表2、圖2。IP-10、MIP-3a的診斷準(zhǔn)確性中等（0.7＜AUC ≤ 0.9），IP-10、MIP-3a聯(lián)合診斷的診斷準(zhǔn)確性較高（0.9＜AUC＜1），聯(lián)合診斷的敏感性和特異性均高于任一單一指標(biāo)。

表1 HCC患者血清IP-10、MIP-3a表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expression level of serum IP-10 and MIP-3a and clinicopathological features in patients with HCC ± s，pg/mL

表1 HCC患者血清IP-10、MIP-3a表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship between the expression level of serum IP-10 and MIP-3a and clinicopathological features in patients with HCC ± s，pg/mL

參數(shù)性別例數(shù)IP-10t值0.656 P值0.513 MIP-3a t值1.547 P值0.125男女78 40 133.64±19.64 131.23±17.38 39.54±7.60 41.91±8.40年齡（歲）＜60≥60腫瘤大小（cm）＜3≥3腫瘤分化高中分化低分化TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移65 53 69 49 85 33 65 53 131.23±18.87 135.23±18.36 130.23±17.08 136.23±18.47 122.37±15.66 158.91±21.64 109.13±16.50 162.91±19.34 1.159 1.818 10.172 16.298 6.670 0.249 0.072 0.000 0.000 0.000 39.25±8.70 41.14±9.02 39.05±7.32 41.61±8.75 37.14±5.47 50.14±10.08 37.30±8.62 48.14±8.10 1.155 1.725 8.991 6.980 9.078 0.251 0.087 0.000 0.000 0.000有無19 99 159.64±19.77 126.23±20.02 57.26±9.37 37.14±8.75 AFP（ng/mL）＜400≥400 1.5600.1211.8510.067 73 45 137.08±20.75 131.23±18.09 39.41±8.33 42.44±9.12

表2 血清趨化因子IP-10、MIP-3a、AFP及IP-10與MIP-3a聯(lián)合診斷的診斷價(jià)值Tab.2 Diagnostic value of combined diagnosis of serum chemokines IP-10，MIP-3a，AFP，IP-10 and MIP-3a

3 討論

研究表明，腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生的某些趨化因子如CXCL12及其配體CXCR4、CXCL8及其配體CXCR1等，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及血管生成等惡性生物學(xué)過程[6]。

MIP-3a可招募表達(dá)其配體CCR6的樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，免疫細(xì)胞活化后提呈抗原，通過免疫反應(yīng)發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)[7]。本研究中，HCC組血清MIP-3a含量顯著高于LC組、CHB組及健康對照組，其機(jī)制可能是肝癌細(xì)胞的抑癌基因TP53突變熱點(diǎn)R249S和V157F發(fā)生突變，腫瘤細(xì)胞獲得干細(xì)胞樣基因表達(dá)特征，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。此外，本研究進(jìn)一步分析HCC組患者血清MIP-3a的表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系，結(jié)果表明HCC組患者M(jìn)IP-3a與腫瘤TNM分期、腫瘤分化及是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化及伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者的血清MIP-3a分別明顯高于分期Ⅰ～Ⅱ、高中分化及不伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。有研究表明MIP-3a可通過PI3K/PKB和Wnt/β-catenin通路途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變（EMT），結(jié)果促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖和遷移[9]。此外，HCC細(xì)胞來源的MIP-3a能誘導(dǎo)單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞表達(dá)吲哚胺2，3-雙加氧酶（IDO），通過在腫瘤微環(huán)境中抑制自然殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的功能，發(fā)揮促進(jìn)HCC進(jìn)展的作用[10]。因此，HCC進(jìn)展受到腫瘤微環(huán)境中HCC產(chǎn)生的MIP-3a的影響，腫瘤分期越高，分化越差，腫瘤細(xì)胞中MIP-3a表達(dá)水平增高越明顯。與此同時(shí)，肝癌細(xì)胞分泌產(chǎn)生的MIP-3a增加，進(jìn)而導(dǎo)致患者血清中MIP-3a水平升高。

圖2 血清IP-10、MIP-3a、兩者聯(lián)合診斷及AFP的ROC曲線Fig.2 Serum IP-10，MIP-3a，combined diagnosis and ROC curve of AFP

IP-10通過與G蛋白偶聯(lián)趨化因子受體CXCR3結(jié)合并激活下游信號傳導(dǎo)，影響淋巴細(xì)胞的募集和定向遷徙，介導(dǎo)炎癥、適應(yīng)性免疫、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和血管生成等過程[11]。有研究表明，HCC腫瘤微環(huán)境中趨化因子IP-10及其配體表達(dá)增加，其表達(dá)水平與血清AFP水平和TNM分期有關(guān)，CXCL10表達(dá)水平較高的患者總生存率和無病生存率顯著低于CXCL10表達(dá)水平較低的患者[12]。本研究發(fā)現(xiàn)HCC組血清IP-10顯著高于LC組、CHB組及健康對照組。HCC組患者血清IP-10的表達(dá)與腫瘤TNM分期、腫瘤分化及是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，其原因可能是CXCL10能促使腫瘤細(xì)胞上調(diào)表達(dá)基質(zhì)金屬肽酶-2（MMP-2），并使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)HCC細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，當(dāng)在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，敲低IP-10表達(dá)或MMP-2的表達(dá)明顯抑制HCC細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13]。本研究進(jìn)一步探討血清趨化因子IP-10、MIP-3a對肝癌的診斷價(jià)值，結(jié)果表明IP-10、MIP-3a聯(lián)合診斷的診斷準(zhǔn)確性較高，聯(lián)合診斷的敏感性和特異性均高于任一單一指標(biāo)，因而兩者有可能成為臨床診斷的新的分子標(biāo)志物。

綜上所述，HCC患者血清趨化因子IP-10、MIP-3a表達(dá)上調(diào)，并且兩項(xiàng)指標(biāo)的表達(dá)水平與TNM分期、病理分級及是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能在HCC發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用。聯(lián)合檢測血清趨化因子IP-10、MIP-3a有希望成為HCC新的診斷、治療及隨訪的腫瘤標(biāo)志物。