狼瘡性腎炎小鼠模型的建立及其鑒定

李艷秋，田淑艷，劉雪，栗霄麗，姚麗，王力寧

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽 110001）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是嚴(yán)重的自身免疫性疾病。SLE使T細(xì)胞功能改變和多克隆B細(xì)胞活化，伴隨自身抗體［抗雙鏈DNA抗體（double strands DNA，dsDNA）等］產(chǎn)生，從而導(dǎo)致多器官免疫復(fù)合物沉積。其中，狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是嚴(yán)重并發(fā)癥，能導(dǎo)致腎功能損傷。人類SLE/LN表型多樣化，臨床上規(guī)范分組復(fù)雜，因此有關(guān)SLE研究多利用動物模型來進(jìn)行。SLE目前有多種動物類型，包括自發(fā)性MRL/LPR、BXSB、轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠［1］。本研究擬觀察新西蘭黑鼠和新西蘭白鼠雜交子一代（NZB×NZW，NZB/W F1）小鼠發(fā)病過程，建立LN模型，為將來SLE/LN的研究和治療提供理想的動物模型。

1 材料與方法

1.1 LN模型建立

30只8周齡NZB/W F1雌性小鼠購自Jackson實驗室，30只8周齡雌性C57BL/6 小鼠購自維同利華動物有限公司，小鼠均在中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部繁殖，按照中國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB 14925-2001）指導(dǎo)原則，小鼠生存條件：濕度50%±20%，溫度23 ℃±3 ℃，12 h光/12 h暗人工循環(huán)，可以自由進(jìn)食和飲水。本研究獲得中國醫(yī)科大學(xué)動物保護和使用委員會批準(zhǔn)。所有動物均于SPF級飼養(yǎng)至28～36周。

1.2 LN模型鑒定

1.2.1 體質(zhì)量測定：每周使用電子臺秤測小鼠體質(zhì)量。

1.2.2 尿蛋白測定：每周對小鼠新鮮尿進(jìn)行檢測。蛋白尿試紙檢測小鼠尿蛋白嚴(yán)重程度：±，5 mg/dL；+，30 mg/dL；++，100 mg/dL；+++，300 mg/dL；++++，1 000 mg/dL［2］。根據(jù)尿蛋白嚴(yán)重程度將小鼠分為輕度LN（±～+）和重度LN（+++～++++）。

1.2.3 小鼠腎功能測定：小鼠8和28周齡時麻醉、殺滅后取血樣。應(yīng)用生化自動分析儀檢測小鼠血肌酐及尿素氮。

1.2.4 小鼠血液dsDNA濃度測定：采用ELISA法測定小鼠dsDNA IgG 濃度（美國Alpha Diagnostic International公司），按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 腎臟形態(tài)學(xué)觀察：8周、28周和36周齡時處死小鼠后，立即留取腎臟皮質(zhì)，2B多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行HE、PAS、MASSON染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SSPS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組小鼠體質(zhì)量比較

結(jié)果顯示，小鼠體質(zhì)量逐漸下降，在22周后趨于穩(wěn)定。見表1。

2.2 2組小鼠死亡情況

C57BL/6 小鼠實驗期間無死亡。NZB/W F1小鼠28周時死亡10只。其中，26號鼠2周內(nèi)體質(zhì)量下降超過20%且尿蛋白（++），處死小鼠（小鼠體質(zhì)量下降過快是死亡信號，需及時留取活體標(biāo)本）；7號死鼠體質(zhì)量未下降，解剖發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)生胸水（700 μL），1周前尿蛋白（++），考慮死因為胸水引起窒息；其他8只小鼠疾病自然病程加重死亡。

2.3 NZB/W F1小鼠LN鑒定

2.3.1 小鼠尿蛋白變化：結(jié)果顯示，8、16、24、28周小鼠重度LN所占比例分別為0、10%、25%、40%。隨著周齡增長，NZB/W F1小鼠出現(xiàn)重度LN概率增加。

2.3.2 小鼠腎功能變化：結(jié)果顯示，隨著周齡增加，NZB/W F1小鼠腎功能（血肌酐和血尿素氮）、dsDNA水平逐漸升高，28周與8周時比較，與同周齡C57BL/6 小鼠比較均升高明顯（均P＜ 0.05）。見表2。

2.3.3 小鼠腎臟病理改變：結(jié)果顯示，8周輕度LN NZB/W F1小鼠僅部分腎小球系膜增寬，細(xì)胞和基底膜基本正常，28周重度LN NZB/W F1小鼠腎小球系膜細(xì)胞增生明顯，可見中性粒細(xì)胞浸潤，基底膜增厚，伴有部分硬化，36周重度LN NZB/W F1小鼠腎小球增生更加明顯，硬化也開始增加，有大量中性粒細(xì)胞浸潤，基底膜僵硬，部分腎小管脫落壞死，36周齡C57BL/6小鼠基本沒有變化，僅腎小球比28周重度LN NZB/W F1小鼠略增大，腎小球與36周重度LN NZB/W F1小鼠大小相同，見圖1。

表1 2組小鼠體質(zhì)量比較（g）

表2 小鼠血肌酐、尿素氮和dsDNA水平比較

3 討論

NZB/W F1小鼠是新西蘭黑鼠和新西蘭白鼠之間的雜交子一代。雜交在3～4個月時形成高滴度自身抗體水平，產(chǎn)生免疫復(fù)合物介導(dǎo)的腎小球腎炎，類似于人類彌漫性增生性腎小球腎炎［3］。

有研究［3］顯示，80%小鼠在8個月時出現(xiàn)大量蛋白尿，90%在12月時死于腎功能不全，因此本研究只觀察至小鼠28周（最多36周）。本研究中NZB/W F1小鼠在12周左右開始出現(xiàn)重度尿蛋白（+++），28周時重度尿蛋白（+++）發(fā)生率為40%。22周后小鼠的腎臟功能逐漸下降，病理改變在逐漸加重。研究［4］報道從3～4月起自身抗體滴度和腎功能指標(biāo)逐漸升高，本研究顯示小鼠28周時 dsDNA和血肌酐已經(jīng)明顯高于8周齡NZB/W F1小鼠和同齡C57BL/6 小鼠（P＜0.05）。 NZB/W F1小鼠腎臟病理呈現(xiàn)典型的彌漫增生性腎小球腎炎，系膜細(xì)胞明顯增生，大量中性粒細(xì)胞浸潤，系膜基質(zhì)增加，腎小球彌漫增生，甚至有部分硬化，部分區(qū)域基底膜僵硬，有局限性腎小管壞死。而C57BL/6小鼠在36周齡仍然沒有任何病理改變。證明NZB/W F1小鼠LN模型建立成功。

SLE是多基因遺傳疾病，是環(huán)境和遺傳等多種因素作用的結(jié)果［5］。DNA降解、凋亡［6］、自噬［7］、細(xì)胞因子的異常［8］、T細(xì)胞和B細(xì)胞的異常［9-10］、激素水平異常［11］、基因和表觀遺傳學(xué)的關(guān)系［12］、基因和基因之間的相互作用［13］等在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但是具體病因仍不十分清楚，迫切需要典型動物模型來完成相應(yīng)的研究課題。國際上大多應(yīng)用新西蘭小鼠回交造模研究遺傳機制，但是由于價格昂貴國內(nèi)很少報道。本研究LN模型成功建立證明NZB/W F1小鼠模型具備LN的典型癥狀，可以為LN發(fā)病機制和治療研究提供重要依據(jù)。

圖1 小鼠腎臟病理結(jié)果 x400