單細胞RNA測序技術(shù)及其在皮膚病學(xué)研究中的應(yīng)用

朱容慧 李巍

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040

生命科學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)的進展在一定程度上得益于新技術(shù)、新方法的進步。單細胞RNA測序技術(shù)能夠在單細胞層面對基因表達水平進行分析，是研究皮膚生理功能和疾病狀態(tài)的新手段。這一技術(shù)的應(yīng)用有望從轉(zhuǎn)錄組水平重新定義多種皮膚疾病亞型，揭示新的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和開發(fā)新的治療策略，具有非常重要的意義。目前單細胞RNA測序在皮膚病領(lǐng)域的應(yīng)用剛剛開始，本文主要介紹單細胞RNA測序的原理、技術(shù)流程及其在皮膚病研究中的初步應(yīng)用，為廣大皮膚科臨床和科研工作者了解并應(yīng)用這一技術(shù)提供參考。

一、單細胞RNA測序技術(shù)簡介

RNA 測序技術(shù)是檢測細胞轉(zhuǎn)錄組的可靠方法，高通量RNA測序技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的諸多研究當中，但普通RNA測序是在組織樣本或細胞群水平上進行的，單個細胞之間的生物學(xué)差異可能被平均，或被誤認為技術(shù)噪音而掩蓋［1］，為了克服這一缺陷，人們研發(fā)了單細胞RNA測序技術(shù)。該技術(shù)是在單細胞水平上對轉(zhuǎn)錄組進行測序，可揭示細胞間的變異和群體的異質(zhì)性，特別適合發(fā)現(xiàn)罕見的細胞群體，為那些數(shù)量少的細胞群體如調(diào)節(jié)性T細胞、朗格漢斯細胞提供了有效的研究方法［2］。單細胞RNA測序技術(shù)在精準醫(yī)學(xué)方面也有良好的應(yīng)用前景，可以區(qū)分出對藥物敏感的細胞和非敏感細胞，指導(dǎo)治療的選擇和藥物的開發(fā)［3］。2013年這項技術(shù)被Nature Method雜志評選為年度技術(shù)，并在過去幾年間在胚胎發(fā)育、癌癥生物學(xué)和免疫學(xué)方面取得了一系列創(chuàng)新性成果［4］。

二、單細胞RNA測序的技術(shù)流程

單細胞RNA 測序技術(shù)與其他RNA 測序的基本原理相似，流程包括細胞制備、文庫構(gòu)建、測序和數(shù)據(jù)分析，見圖1。其中單細胞制備和單細胞文庫構(gòu)建是最重要的環(huán)節(jié)，決定了數(shù)據(jù)質(zhì)量、測序通量、精確度、靈敏度和可重復(fù)性［5］。

單細胞的分離制備技術(shù)目前主要有流式細胞分選術(shù)、免疫磁珠細胞分選技術(shù)、顯微操作法、微流控技術(shù)、梯度稀釋法、激光捕獲顯微切割技術(shù)等，比較常用的是前4種。

流式細胞分選技術(shù)［6］是對單細胞懸液預(yù)先用熒光標記細胞表面特異性分子，利用細胞結(jié)合的熒光標記或細胞本身的光散特性，高效、快捷地從大量細胞中分選出特定的細胞，適用于大樣本中特定細胞類型的分選。但是，該技術(shù)對樣本制備、儀器操作要求較高，而且這種方法對細胞機械損傷較大，需要盡快進行下一步操作。

圖1 單細胞轉(zhuǎn)錄組測序流程

磁珠分選［7］是預(yù)先對單細胞懸液中的細胞進行特異性磁性標記，經(jīng)穩(wěn)定磁場中的分選柱洗脫后篩選出標記細胞，對細胞刺激小，細胞活性高，技術(shù)操作簡單。但是，分選純度只在80%～90%之間，而且每次操作只能分為標記和未標記兩群細胞，不能進行多參數(shù)的分群。

顯微操作法［8］是在顯微鏡視野下直接對固體的組織進行單細胞分離，優(yōu)點是可以進行可視化操作，耗材較低，適用于較小的細胞群體中目標細胞的分離。但是該技術(shù)操作難度因操作者和組織細胞而異，分離通量也較小。

微流控技術(shù)［9］是利用流控通道具備的功能，如通道可調(diào)節(jié)的直徑（10～100 μm）和功能性修飾（如捕獲分子、抗體、電極等），人為地控制液體流動來進行細胞分選，如C1?單細胞全自動制備系統(tǒng)，只需要將細胞樣品加在C1?微流體芯片上，輸入指令，該系統(tǒng)就會快速自動分離出96 或384個單細胞并分配到單個制備倉中，之后系統(tǒng)還會自動地裂解、逆轉(zhuǎn)錄、擴增、檢測和分析細胞，在實現(xiàn)大通量的同時免除了繁重的加樣和混合步驟，大大節(jié)約了實驗時間，降低了操作帶來的實驗誤差。但是該系統(tǒng)要求大量具有高度均一性的樣本細胞，限制了對數(shù)量稀少或者異質(zhì)性高的細胞的研究，而且設(shè)備昂貴，成本較高。

死細胞釋放的游離RNA 會影響單細胞RNA 數(shù)據(jù)的質(zhì)量，因此在制備單細胞時最重要的是保持細胞的活力。在選擇方法時，主要是針對組織和細胞的性質(zhì)選擇對細胞損傷盡可能小的方式進行操作。除了方法本身對細胞可能帶來的損傷外，移液、振蕩、離心、細胞所處的溫度和基質(zhì)都會對細胞活力產(chǎn)生影響，所以應(yīng)該綜合考慮各種因素，選擇對保持細胞活力最優(yōu)的方案，盡可能提高數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

單細胞文庫的構(gòu)建方法早期主要分為兩種：一種是將單細胞分離后置于96 孔板中進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后加上PCR 擴增的接頭和細胞識別條形碼，轉(zhuǎn)移到單個管中進行PCR擴增?；谶@種方法的技術(shù)有單細胞標記逆轉(zhuǎn)錄測序（single-cell tagged reverse transcription sequencing，STRT-seq）［10］、Smart 測序技術(shù)（switching mechanism at 5′end of RNA template，Smart-seq）［11］、改良 Smart 測序技術(shù)（Smart-seq2）［12］等，這種方法覆蓋度較好，但一次能測序的細胞數(shù)少，步驟繁瑣。另一種方法是在反轉(zhuǎn)錄的引物上加上細胞條形碼對單個細胞進行反轉(zhuǎn)錄，第二鏈合成后，將所有反應(yīng)管的cDNA混合，利用體外轉(zhuǎn)錄進行線性擴增［13］。這種方法包括線性擴增測序（cell expression by linear amplification and sequencing，CEL-seq）［13］、改良線性擴增測序（CEL-seq2）［14］、高通量平行擴增測序（massively parallel single-cell RNA sequencing，MARS-seq）［15］等。但這兩種方法都是利用96 孔板或384 孔板為操作平臺，由于孔數(shù)的局限，限制了單細胞RNA測序規(guī)模的擴大。2015年哈佛醫(yī)學(xué)院Steven McCarroll研究團隊利用微流控技術(shù)開發(fā)液滴測序（Droplet sequencing ，Drop-seq），將帶有條形碼引物的微珠和細胞在油乳劑中壓縮為一個液滴，在液滴中進行建庫，由此檢測數(shù)以千計的細胞［15-17］。這種技術(shù)可以大量無偏倚地挑選細胞進行測序，極大提高了實驗的通量，同時也不需要細胞具有較高的均一性，但這種方法覆蓋率比較低，在單個細胞中檢測到的轉(zhuǎn)錄組只有其他方法的一半［18］?；贒ropseq，10X Genomics 公司和 Fred Hutch 的團隊開發(fā)了一套新的技術(shù)并且商業(yè)化推廣，可在6 min 內(nèi)完成擴增測序，能夠同時分析來自29 個不同樣品的250 000 個單細胞，大大加速了單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究［19］。2018年浙江大學(xué)Han等［20］研發(fā)微孔測序技術(shù)（Microwell-Seq），利用磁珠將細胞吸附在用瓊脂構(gòu)建的微孔陣列中，再加入條形碼微珠進行測序，一次可以測序＞400 000個單細胞，這種方法顯著提升了測序通量，又保證了靈敏度，降低了測序成本。

三、單細胞RNA測序在皮膚病學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用

目前在皮膚相關(guān)領(lǐng)域使用單細胞RNA 測序技術(shù)的研究較少。Joost等［21］首先利用這種技術(shù)研究了小鼠正常皮膚表皮的結(jié)構(gòu)和組成，對小鼠毛囊間和毛囊的表皮細胞進行測序，得到1 422 個單細胞數(shù)據(jù)，根據(jù)細胞群標志性基因區(qū)分出25群不同種類的細胞，例如，將高表達Scd1/Mgst1的細胞劃分為皮脂腺細胞，以Krt6a/Krt75、CD34/Postn 標記內(nèi)、外根鞘角質(zhì)形成細胞，分別用CD207 和CD3 標記朗格漢斯細胞和T細胞這兩個免疫細胞群。研究者使用免疫組化和單分子熒光原位雜交技術(shù)分別從蛋白水平和組織水平驗證細胞分群的存在，同時對細胞分群進行空間定位，將角質(zhì)形成細胞從基因表達和空間位置上分為更詳細的亞類。他們還進一步發(fā)現(xiàn)在不同空間位置的表皮干細胞有共同的基底-表皮基因表達模式。該研究顯示了單細胞RNA 測序技術(shù)在識別皮膚角質(zhì)形成細胞亞群上的強大能力。

Cheng等［22］利用單細胞RNA測序技術(shù)分析正常人體不同部位表皮角質(zhì)形成細胞的基因特征以及銀屑病皮損角質(zhì)形成細胞基因表達的變化。該實驗獲取9 例正常人和3 例銀屑病患者的頭皮、軀干和包皮3個不同部位的皮膚組織，獲得92 889 個單細胞數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)混合分析后發(fā)現(xiàn)，將這些數(shù)據(jù)混合分析后發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄組水平，不同解剖部位的角質(zhì)形成細胞不僅在組織學(xué)上分為不同的亞群，也在細胞執(zhí)行的功能上分為不同的亞群，比如執(zhí)行細胞間信號傳導(dǎo)功能的亞群、與炎癥反應(yīng)相關(guān)的亞群和與WNT信號通路調(diào)控有關(guān)的亞群。此外這項研究還進一步發(fā)現(xiàn)表皮在轉(zhuǎn)錄組水平上的一些炎性特征：①正常頭皮部位角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)錄組中存在固有的炎癥表達模式，即毛囊間角質(zhì)形成細胞S100分子活化；②正常包皮的表皮免疫細胞中存在一群其他部位表皮中沒有的IL1βhiCCL3hiCD14+巨噬細胞，提示在泌尿道表皮中有與這群細胞相關(guān)的特殊炎癥反應(yīng)；③銀屑病患者皮損中有大量CD1C+CD301+的髓樣樹突細胞的富集。該研究在mRNA 水平展示了正常人包皮、頭皮和軀干部位的表皮以及銀屑病患者的表皮細胞基因表達狀態(tài)，為進一步研究更深層次的相關(guān)問題，尤其是關(guān)于基底層角質(zhì)形成細胞執(zhí)行不同分化程序的能力以及免疫細胞向銀屑病皮損部位的募集過程奠定了重要基礎(chǔ)。

Kobayashi 等［23］對表皮、真皮和皮下組織的固有淋巴樣細胞（innate lymphoid cells，ILC）進行單細胞RNA測序，分別得到3 431、3 356、1 061 個單細胞數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ILC 在皮膚的這3 個部位有特異性的轉(zhuǎn)錄表達譜。其中，皮下組織處的ILC表現(xiàn)出ILC2的轉(zhuǎn)錄特征，在真皮和表皮的ILC又各分為兩群，真皮部位的兩群細胞可能分別執(zhí)行不同的功能，而表皮的兩群可能表現(xiàn)了兩種不同的細胞激活狀態(tài)。ILC 在不同部位的分群與上皮細胞分泌的細胞因子與趨化因子有關(guān)。這部分研究說明,不同組織部位的特有信號促進皮膚ILC 的增殖，誘導(dǎo)不同的基因表達。在此基礎(chǔ)上，他們研究毛囊皮脂腺附近的RORgt+ILC，發(fā)現(xiàn)這群細胞可能參與毛囊-皮脂單位的調(diào)節(jié)。進一步研究發(fā)現(xiàn),表皮ILC 可以通過抑制Notch信號通路限制皮脂腺細胞的生長，可能影響皮膚表面具有抗菌活性的游離脂肪酸的分泌，從而限制革蘭陽性菌的共生。該研究通過單細胞RNA 測序為研究皮膚稀有的免疫細胞提供了技術(shù)可能，進一步探究了皮膚免疫細胞與皮脂腺、共生菌群的關(guān)系，為皮膚免疫細胞如何調(diào)節(jié)皮膚穩(wěn)態(tài)提供了新的思路。

單細胞RNA 測序技術(shù)是研究腫瘤細胞異質(zhì)性和腫瘤微環(huán)境組成的強有力工具，已在乳腺癌［24］、頭頸部鱗狀細胞癌［25］、神經(jīng)膠質(zhì)瘤［26］等疾病中得到了應(yīng)用。Tirosh等［27］獲取了19 例黑素瘤患者腫瘤組織中4 645 個單細胞測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞的聚類顯示了腫瘤細胞間與細胞周期、空間環(huán)境和耐藥性相關(guān)的異質(zhì)性；小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）基因簇高表達或AXL受體酪氨酸激酶（AXL）基因簇高表達的細胞群體受到特別關(guān)注，因為這兩個基因簇的表達可能對黑素瘤細胞的存活和耐藥性至關(guān)重要。該研究顯示,所有的腫瘤細胞都可以分為MITF 高表達和MITF 低表達/AXL 高表達的兩個群，同時在MITF高表達群中發(fā)現(xiàn)了AXL高表達的黑素瘤細胞亞群。研究者同時對腫瘤內(nèi)的非惡性細胞進行聚類分析，解析了腫瘤微環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中存在多種T細胞抑制性受體基因的表達，如程序性死亡分子1、T細胞免疫球蛋白與免疫受體酪氨酸抑制分子、T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子3、淋巴細胞活化分子3和細胞毒性T細胞相關(guān)蛋白4等，抑制性受體基因的表達和T細胞活化狀態(tài)高度相關(guān)，提示黑素瘤中存在共刺激分子激活的T 細胞衰竭機制，可以作為免疫治療的靶點。該研究結(jié)果對黑素瘤的分型和腫瘤的精準治療具有重要的指導(dǎo)意義，而這些結(jié)果無法通過普通高通量RNA測序得到，證明單細胞RNA測序在研究腫瘤亞群和腫瘤微環(huán)境中具有無可比擬的作用。

四、研究前景展望

對于正常皮膚，利用單細胞RNA測序技術(shù)可能會發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下以前未定義的皮膚細胞亞群，包括角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞、樹突細胞和T 細胞等，這些新亞群可能在維護皮膚穩(wěn)態(tài)、發(fā)揮其屏障功能中起到不同的作用，通過這些發(fā)現(xiàn)從而獲得對皮膚生物學(xué)功能更全面的理解。對于炎癥性和自身免疫性皮膚病，如銀屑病、特應(yīng)性皮炎、白癜風(fēng)、紅斑狼瘡和大皰性皮膚病等，通過單細胞RNA測序可能會找到在發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用的靶細胞，發(fā)現(xiàn)與疾病發(fā)展相關(guān)的新的免疫細胞亞群，包括自身反應(yīng)性T細胞或B細胞等，從而能更準確地定義疾病的特征，對疾病狀態(tài)有更精準的分型；對于關(guān)鍵的免疫細胞，還可以捕捉不同分化階段的細胞進行單細胞RNA測序分析，重建細胞“decision making”的關(guān)鍵點和生長分化的過程，從而了解從健康向疾病轉(zhuǎn)換過程中免疫細胞如何分化，如T細胞向輔助性T細胞、細胞毒性T細胞或調(diào)節(jié)性T細胞分化。對于皮膚腫瘤，如鱗狀細胞癌、基底細胞癌、皮膚T 細胞淋巴瘤和黑素瘤，單細胞RNA測序?qū)椭覀冏R別新的皮膚腫瘤亞型和腫瘤浸潤細胞，為新的腫瘤免疫治療靶點提供線索。此外，在全長單細胞RNA測序數(shù)據(jù)中，還可以讀到成對或全長的T細胞受體/B細胞受體序列［28］，將計算機重建的T細胞受體或B細胞受體信息與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)合，可以確定與皮膚腫瘤和自身免疫性疾病相關(guān)的腫瘤特異性抗原和自身抗原。利用單細胞RNA 測序揭示疾病的發(fā)病機制，最重要的是可以為皮膚疾病的治療提供新方案，如根據(jù)腫瘤特異性抗原或自身抗原開發(fā)嵌合抗體；通過識別對藥物敏感的細胞亞群的特征設(shè)計更敏感的靶向藥物；針對疾病的不同亞型采取對應(yīng)的治療方案等。

然而目前單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)還存在一些問題，除了通量和成本的限制，數(shù)據(jù)處理也是一個挑戰(zhàn)，例如如何用復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)判斷單個細胞的類型、定義不同的細胞亞群，怎樣挖掘出細胞群體與功能相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組特征，從而在分子水平給細胞群體的生物學(xué)功能做出更完整的描述。隨著單細胞研究浪潮的來臨，未來單細胞測序領(lǐng)域會得到極速的發(fā)展，相信更多的局限也將被突破。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突