中藥及天然產(chǎn)物單分子組分抗腫瘤免疫機理

王靳，李丹，李斌

上海交通大學 醫(yī)學院 上海市免疫學研究所，上海 200025

美國癌癥研究協(xié)會(AACR)2018年的癌癥進展報告顯示，自1990年以來美國癌癥總體死亡率持續(xù)下降，1991—2014年期間僅美國就有240萬癌癥患者存活。逐漸上升的腫瘤五年存活率離不開活躍的基礎科研。自從2013年腫瘤的免疫療法被Science雜志評為十大科學進展之首，腫瘤免疫就開始從基礎研究走向公眾視線。2018年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎頒發(fā)給本庶佑(Tasuku Honjo)和詹姆斯?艾利森(James P. Allison)，他們的研究發(fā)現(xiàn)并推動了一種抑制負向免疫調(diào)節(jié)的癌癥療法。傳統(tǒng)的化療和放療方法很大程度上無法區(qū)別腫瘤細胞與正常細胞，致使無差別的細胞死亡，而免疫療法主要通過激活自身免疫系統(tǒng)，特異性地清除腫瘤細胞?，F(xiàn)有的免疫療法主要包括樹突狀細胞疫苗、免疫檢查點抑制劑、嵌合抗原受體T細胞療法(CAR-T)、溶瘤病毒等。

中醫(yī)是中華民族的傳統(tǒng)醫(yī)學，善于從整體出發(fā)診療疾病。中醫(yī)對于腫瘤的治療可概括為“清熱祛毒”“扶正固本”“活血化瘀”“消痰散結”四方面[1]。扶正固本又稱固本培正，與免疫療法的概念有大面積重疊，即提高自身免疫力，調(diào)節(jié)血液和腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的功能，促進免疫細胞釋放促炎性細胞因子，利用免疫細胞殺傷腫瘤細胞。目前，中藥抗腫瘤領域已經(jīng)取得了大量的臨床數(shù)據(jù)，臨床試驗證明中藥在癌癥復發(fā)和轉(zhuǎn)移的治療和預防中發(fā)揮作用，可顯著延長腫瘤患者術后生存時間[2-3]。由于中成藥成分復雜，很多情況下難以確定其主要活性成分，當前的研究主要針對中藥中單一成分提取物或單分子，故本文圍繞中藥單分子或提取物來討論其在抗腫瘤免疫中發(fā)揮的作用。

1 中藥調(diào)節(jié)固有免疫抗腫瘤

根據(jù)能否特異性識別病原體，可將免疫系統(tǒng)分為固有免疫和適應性免疫兩部分。固有免疫由皮膚、黏膜和固有免疫細胞三部分組成。又可以根據(jù)形態(tài)、顆粒度、趨化性以及行使的功能，將固有免疫細胞分為中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀(DC)細胞、自然殺傷(NK)細胞等。固有免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮多重作用，包括但不限于促進炎癥反應，免疫抑制，參與腫瘤血管形成。中藥可活化特定的固有免疫細胞，通過增強抗原提呈或細胞免疫過程來殺傷腫瘤細胞，也可以通過抑制某些固有免疫細胞如腫瘤浸潤巨噬細胞的活性，抑制腫瘤微環(huán)境中血管的形成以及腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。

1.1 通過促進樹突狀細胞成熟促進抗腫瘤免疫

樹突狀細胞(DC)來源于骨髓的CD34+造血干細胞，1973年由Steinman及其同事首次發(fā)現(xiàn)并進行描述[4]，是已知最有效的抗原提呈細胞。存在于血液或淋巴組織中的未成熟樹突狀細胞尋找并吞噬病原體，將其抗原暴露；已成熟并攜帶抗原的樹突狀細胞在次級淋巴組織將抗原肽呈遞給淋巴細胞，并激活幼稚T細胞。1992年Inaba和Steinman證明小鼠樹突狀細胞可以從骨髓前體離體培養(yǎng)[5]，為樹突細胞疫苗的產(chǎn)生埋下伏筆。樹突狀細胞疫苗主要制備流程：從患者去除淋巴細胞和白細胞的外周血單個核細胞中分離培養(yǎng)未成熟樹突狀細胞，加入細胞因子TNF-α等刺激樹突狀細胞成熟，將設計好的多肽片段作為抗原加載到成熟的樹突狀細胞上，通過皮下注射回輸至患者體內(nèi)，促進抗腫瘤免疫應答[6]。

中藥能夠促進樹突細胞的成熟，從而通過增加促炎性細胞因子的分泌和共刺激因子的表達來增強免疫應答反應。胡玉平等發(fā)現(xiàn)牡丹皮提取物丹皮酚能夠通過誘導樹突狀細胞成熟，刺激樹突狀細胞分泌細胞因子來提高樹突狀細胞的抗原提呈與激活能力[7]，具體表現(xiàn)為丹皮酚處理過的樹突狀細胞表面MHC-II類分子、CD40和CD60的表達量增加，促炎性細胞因子IL-12的分泌增加，且分泌量呈現(xiàn)劑量依賴關系。枸杞中的主要活性成分枸杞多糖可上調(diào)樹突狀細胞表面激活標志物CD11c表達，通過 TLR2/TLR4 介導的NF-κB通路誘導 DCs 成熟。枸杞多糖處理過的樹突狀細胞能夠更有效地促進淋巴細胞的激活和增殖，強化免疫應答反應[8]。因此，將中藥作為樹突狀疫苗的輔助治療手段，可以取得更好的臨床治療效果。

1.2 提高自然殺傷細胞毒性促進抗腫瘤免疫

NK細胞兼具識別和消滅腫瘤細胞的功能。正常的細胞表面高表達MHC-I類分子，腫瘤細胞表面的MHC-I類分子表達量變低或發(fā)生改變。NK細胞可及時檢測細胞表面MHC-I類分子的改變，判斷其是否為惡性腫瘤細胞，接著通過兩種方式(圖1)清除腫瘤細胞：NK細胞表面的Fc受體識別腫瘤細胞表面由IgG包被的腫瘤抗原，緊接著釋放顆粒酶B和穿孔素裂解腫瘤細胞，這一途徑被稱為抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)；或者通過自身細胞表面的天然細胞毒性受體(NCR)與腫瘤細胞表面的抗原結合，活化的NK細胞裂解腫瘤細胞[9]。除了識別并消滅腫瘤細胞外，NK細胞還能夠幫助腫瘤特異性的CD4+、CD8+T細胞形成及應答[10]。在鱗狀細胞肺癌、結直腸癌及胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤局部NK細胞的比例越高，患者預后越好[11]。

圖1 NK細胞通過兩種方式殺傷腫瘤細胞

枸杞多糖可以增加NK細胞表面受體NKp30的表達，促進IFN-γ和穿孔素的分泌，使細胞毒性顯著增加[12]。秦韜等將NK細胞與樹突狀細胞共同孵育后使用羥乙基化猴頭菇多糖處理，發(fā)現(xiàn)猴頭菇多糖和羥乙基化猴頭菇多糖均能夠協(xié)同NK細胞使DC細胞IL-12、IL-15、IL-18、NF-κB mRNA表達量顯著提升，同時猴頭菇多糖和羥乙基化猴頭菇多糖也能夠協(xié)同DC細胞使NK細胞中NKG2D、TNF-α、IFN-γ和GM-CSF的 mRNA 表達增加，增強NK細胞與DC細胞之間的相互作用，提高免疫活性[13]。多酚類化合物白藜蘆醇在抗腫瘤領域中也發(fā)揮著獨特的作用。白藜蘆醇廣泛存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中，對免疫系統(tǒng)有雙重調(diào)節(jié)功能，被證實具備多方面的抗癌作用。在體外使用低濃度的白藜蘆醇(0.33～5.48 μmol/L)處理NK細胞后，NK細胞殺傷活性增加，且其殺傷能力與白藜蘆醇存在濃度依賴型雙相效應[14]。另一種天然產(chǎn)物，韓國槲寄生凝集素，被證實可以促進免疫反應。韓國槲寄生凝集素在體外可通過激活NK細胞表面受體NKG2D來促進JNK磷酸化，JNK-STAT信號傳導通路被激活，最終導致NK細胞中穿孔素表達增加，NK細胞對于腫瘤細胞的殺傷活性增強[15]。存在于紫草中的萘醌化合物紫草素能夠促進NK細胞的增殖，并且以劑量依賴方式促進NK細胞中穿孔素和顆粒酶B的表達，增強其對結腸癌細胞的毒性[16]。

圖2 巨噬細胞促進腫瘤微環(huán)境中血管生成

1.3 抑制腫瘤浸潤巨噬細胞的極化

同屬于固有免疫細胞的巨噬細胞在抵御病原體、維持組織穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著廣泛的功能。巨噬細胞可被廣泛地分為兩類：經(jīng)典活化型M1(classical M1)和選擇性活化型M2(alternative M2)。其中，M1型巨噬細胞高表達促炎因子IL-6、I-10、IL-23和腫瘤壞死因子TNF-α，功能包括促炎、清除病原體、抗腫瘤免疫等；M2型巨噬細胞的功能包括抗炎，參與傷口愈合和原發(fā)性腫瘤的形成。存在于腫瘤微環(huán)境中的腫瘤相關巨噬細胞(Tumor associated macrophage，TAM)的表型更傾向于M2型巨噬細胞：高表達抑炎因子IL-10，低表達促炎因子IL-12。TAM參與抗炎、免疫抑制和腫瘤血管形成等過程(圖2)，通過分泌生長和蛋白水解酶來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進腫瘤細胞的侵襲[17]。巨噬細胞向腫瘤微環(huán)境中浸潤通常與疾病進展有關。臨床數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌晚期(III+IV)腫瘤患者的TAM密度顯著高于早期患者(I+II)。在子宮內(nèi)膜癌、泌尿生殖系統(tǒng)癌癥、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌患者中，TAM的密度與總體生存期(OS)存在顯著相關性[18]。

中藥可以抑制TAM的M2樣極化，阻滯腫瘤的生長、遷移。有學者研究發(fā)現(xiàn)，蓼科植物大黃、虎杖的根莖提取物大黃素可通過靶向抑制IRF4、STAT6、5CEBPβ信號傳導過程來抑制TAMs的M2樣極化，減少乳腺癌細胞中趨化因子MCP-1和巨噬細胞集落刺激因子CSF-1的分泌，從而減少巨噬細胞向腫瘤組織的遷移。大黃素能夠阻斷乳腺癌細胞與TAMs間的前饋回路，減少巨噬細胞向腫瘤組織浸潤和M2樣巨噬細胞的活化。大黃素還可以降低TAMs中黏附分子ICAM-1的表達和乳腺癌細胞膜表面糖蛋白Thy-1的表達，阻斷兩種細胞類型之間的黏附，抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[19]。腫瘤微環(huán)境中血管生成除了滋養(yǎng)腫瘤細胞、促進其生長外，也與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關。香菇多糖是從香菇中提取得到的具有生物活性的化合物，香菇多糖能夠促進血管生成抑制因子IFN-γ的表達，從而抑制腫瘤血管生成[20]。

2 中藥調(diào)節(jié)適應性免疫抗腫瘤

適應性免疫為脊椎動物所特有，具備三個特點：特異性、多樣性、記憶性。依據(jù)功能可將適應性免疫細胞劃分為輔助性T細胞(Th cells)、調(diào)節(jié)性T細胞(Treg cells)、細胞毒性T細胞(cytoxic T cell，CTL)和B細胞四大類。CAR-T細胞療法、免疫檢查點阻斷劑的概念均來源于對淋巴細胞分子層面的探索。目前，中藥單分子調(diào)節(jié)適應性免疫方面的研究已經(jīng)深入到對于某一特定信號通路的阻斷/激活，從而激活或抑制某類免疫細胞。

2.1 促進淋巴細胞增殖活化

前文已經(jīng)提到，腫瘤細胞的表面抗原有別于正常細胞，攜帶相應受體的T細胞可以據(jù)此識別腫瘤細胞，負責這一過程的是細胞毒性T細胞。細胞毒性T細胞可在輔助性T細胞的幫助下特異性地識別并殺傷腫瘤細胞。CAR-T療法就是針對腫瘤表面的特異性抗原，體外改造T細胞受體，增強其特異性，達到更好的抗腫瘤效果。

研究尚未發(fā)現(xiàn)能夠顯著提高T細胞特異性的中藥單分子，但已發(fā)現(xiàn)在體外人參皂苷Rg1可以促進CD4+T細胞的激活，增加IL-4 mRNA的轉(zhuǎn)錄從而促進幼稚CD4+細胞向Th2細胞的分化，并且在Rg1刺激下，CD4+T細胞分泌的IL-2上升[21]，起到增強免疫反應的作用。

值得注意的是，淋巴細胞活性過強也會導致機體損傷。CAR-T治療期間由于細胞因子釋放綜合癥(CRS)引發(fā)的高熱、神經(jīng)系統(tǒng)異常、低血壓等不良反應[22]使得CAR-T細胞療法適用人群受到限制，因而下一步研究需要針對這一問題尋找對應的中藥，削弱細胞因子誘導產(chǎn)生的副作用，解決CAR-T治療中的副反應問題。

2.2 解除免疫抑制促進免疫應答

增強T細胞的殺傷活性、提高T細胞的特異性還不夠，腫瘤細胞還存在著獨特的逃逸機制。腫瘤細胞表面存在著一類獨特的抗原，被T細胞識別后可誘導T細胞失活，如腫瘤表面的PD-L1與其配體PD-1結合后，可通過抑制PI3K-AKT-mTOR通路損害T細胞的代謝重編程。針對免疫檢查點開發(fā)出的阻斷劑Opdivo、Keytruda等實則為抗PD-1抗體或抗PD-L1抗體。這些靶向藥物與腫瘤細胞表面的PD-L1或T細胞表面的PD-1競爭性結合靶位點，使得PD-1與PD-L1無法正常結合，T細胞能夠持續(xù)激活并行使殺傷功能。假如腫瘤表面的PD-L1表達減少，也可以讓T細胞的激活過程免受負向調(diào)節(jié)(圖3)。中藥雷公藤中的雷公藤甲素被發(fā)現(xiàn)能夠抑制人乳腺癌細胞表面由IFN-γ誘導的PD-L1表達，通過下調(diào)PD-1/PD-L1通路，激活T細胞的腫瘤免疫活性[23]。

除了腫瘤細胞表面的抑制性受體介導腫瘤免疫耐受，調(diào)節(jié)性T細胞同樣能夠抑制腫瘤免疫。同細胞毒性T細胞一樣，Treg細胞被趨化因子CCL12等招募到腫瘤部位，通過分泌抑炎性細胞因子、接觸抑制等方式抑制CTL活性。與M2型巨噬細胞相似，Treg細胞能夠抑制Th1細胞釋放細胞因子，促進腫瘤微環(huán)境中的血管生成[24]。此外，由于腫瘤組織的缺氧微環(huán)境，Treg細胞促進細胞凋亡基因的表達量增加，抑制細胞凋亡基因的表達量降低。凋亡過程中的Treg細胞釋放大量ATP，由CD39/CD73通路轉(zhuǎn)化為腺苷釋放，被CTL細胞膜表面的腺苷受體A2a結合、識別后抑制CTL細胞活性[25]從而抑制抗腫瘤免疫。

Treg細胞的標志性分子——叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子3(FOXP3)，它的正常表達是Treg細胞維持免疫耐受功能的關鍵因素，轉(zhuǎn)錄水平可以決定Treg的功能。雷公藤甲素能夠降低淋巴細胞中FOXP3的轉(zhuǎn)錄水平，降低血液中Treg細胞比例[26]。傳統(tǒng)中藥玉屏風散中的活性成分——黃芪多糖可以通過恢復細胞因子失衡，降低FOXP3在肝細胞癌局部腫瘤微環(huán)境中的表達來抑制CD4+CD25highTreg細胞的生長和增殖。黃芪多糖可能通過阻斷SDFF-1與其配體的結合來抑制CXCR4/CXCL12通路，防止Treg向腫瘤微環(huán)境中遷移[27]。

近年來，對于FOXP3蛋白翻譯后修飾的研究表明，上調(diào)或下調(diào)FOXP3蛋白甲基化、乙?；?、泛素化等表觀水平修飾會影響Treg細胞的免疫抑制功能。筆者所在的課題組分別于2013年和2016年發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 蛋白泛素化相關的酶類Stub1 能夠促進 FOXP3 的 K48 連接的泛素化修飾并導致其蛋白降解[28]；去泛素化酶USP7 和 USP21 可通過去泛素化作用穩(wěn)定 FOXP3，從而增強Treg細胞的功能[29]。研究發(fā)現(xiàn)，PIM1也能夠介導FOXP3磷酸化，影響Treg的免疫抑制活性[30]。

大量數(shù)據(jù)支持長期慢性炎癥與胃腸道腫瘤風險增加有關[31]。盡管Treg細胞的的免疫抑制功能阻止了抗腫瘤免疫應答，但其抑炎功能可以防止慢性炎癥向癌癥的轉(zhuǎn)變。從藤黃屬植物山木瓜中提取得到的小分子化合物Cambogin能夠通過去泛素化酶USP7穩(wěn)定FOXP3蛋白，從而使Treg細胞發(fā)揮免疫抑制功能，抑制結腸炎的疾病進展[32]。山柰酚是一種天然黃酮類化合物，廣泛存在于茶葉、西蘭花、翠雀草、金縷梅、葡萄柚、蘋果等植物中。作為PIM1的抑制劑，山柰酚能夠通過抑制FOXP3磷酸化來增強FOXP3+Treg細胞的抑制能力；此外，山柰酚能夠增加Treg細胞中的FOXP3表達水平，改善由膠原誘導的關節(jié)炎大鼠模型的病理情況[33]。

未來對于中藥小分子的研發(fā)也可從Treg細胞特征蛋白的翻譯后修飾入手，通過上調(diào)或下調(diào)其免疫抑制功能，如使用PIM-1抑制劑等手段[34]，促進抗腫瘤免疫。

圖3 PD-1抑制T細胞活性原理與PD-1抑制劑的作用機制

3 小結與討論

中醫(yī)是上千年經(jīng)驗醫(yī)學的集成，對于使用動植物提取物治療疾病有著獨特的見解。天然化合物與經(jīng)驗醫(yī)學的結合往往給人帶來驚喜，目前的主流抗癌藥物喜樹堿、長春新堿、紫杉醇最初分別從喜樹、長春花、紅豆杉中提取和分離得到。我們應當繼續(xù)從典籍記載具有特殊功效的方劑中發(fā)掘更多成分明確、機理清楚的中藥提取物或小分子，再針對中醫(yī)在癌癥治療過程中的優(yōu)勢和特點，將中醫(yī)作為癌癥輔助治療的手段，在臨床中實現(xiàn)更好的腫瘤治愈率。