地膜對植椒土壤生物學(xué)特性和細菌多樣性的影響*

劉岳飛 吳人敏 張傳進 姚華開 楊尚東，2?

（1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004）（2 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室，南寧 530007）

廣西是我國最大的秋冬蔬菜生產(chǎn)基地，其中辣椒的種植面積最大［1］。隨著人民生活水平及對蔬菜品質(zhì)要求的提高，辣椒生產(chǎn)中運用地膜越來越廣泛。覆蓋地膜不僅具有促進水土保持與防治雜草滋生等作用，也有利于提高土壤溫度、促進土壤微生物對有機殘體的分解，提高土壤有效養(yǎng)分含量［2］，而且能保水保墑、抑制雜草、改善土壤結(jié)構(gòu)［3］和提高土壤肥力，降低生產(chǎn)成本［4-5］。盡管地膜在調(diào)節(jié)地溫方面發(fā)揮著重要作用，但長期覆蓋地膜在提高土壤溫度的同時往往也會加速土壤有機質(zhì)降解，從而導(dǎo)致土壤有機質(zhì)含量下降，進而影響土壤肥力和生態(tài)系統(tǒng)功能［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，覆蓋地膜調(diào)控土壤溫度主要取決于薄膜對光的透過率和反射率，即：很大程度上取決于薄膜的顏色：無色透明膜對促進地溫升高效果最好，但容易滋生雜草；黑色地膜雖然能有效防止雜草，但升溫效果不及透明膜［8］。這些結(jié)果表明，不同地膜的作用效果不同，而實際生產(chǎn)中如果盲目地使用地膜，長期連續(xù)或全程覆膜將有可能惡化土壤生態(tài)條件，導(dǎo)致土壤肥力下降［9］。近年來，雖然國內(nèi)外對覆蓋地膜影響辣椒生長、產(chǎn)量的研究較多，但大多數(shù)研究聚焦于地上部生理指標(biāo)以及根系分泌物，而且涉及地膜的應(yīng)用研究多集中在北方寒冷地區(qū)。目前，我國南方地區(qū)地膜使用量和地膜覆蓋面積呈逐年增加的趨勢［10］，雖然地膜對作物生長發(fā)育、產(chǎn)量、品質(zhì)及土壤理化性質(zhì)、水分利用效率等方面至今已有較多的研究［11］，但應(yīng)用不同地膜對土壤微生物多樣性的影響研究多集中于我國北方地區(qū)［12-13］。南方地區(qū)應(yīng)用地膜對土壤微生物多樣性的影響鮮見報道。

鑒于此，本文研究覆蓋不同種類地膜對我國南方植椒土壤溫度、理化性狀及生物學(xué)特性的影響，旨在評價覆蓋地膜對植椒土壤肥力與健康狀況的影響，為我國南方地區(qū)科學(xué)利用地膜提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗于2016年在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜生產(chǎn)基地（東經(jīng)108°18′，北緯22°51′）進行，辣椒品種為“桂椒8號”，于2月下旬育苗，4月中旬定植。試驗地土壤類型為赤紅壤，試驗前土壤pH6.08, 有機質(zhì)含量7.30 g·kg-1，全氮0.82 g·kg-1，全磷0.51 g·kg-1，全鉀14.57 g·kg-1，堿解氮57.60 mg·kg-1，有效磷3.22 mg·kg-1，速效鉀82.94 mg·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)五個處理：不覆膜對照（M1）和覆蓋黑色聚乙烯地膜（黑色地膜，M2）、無色透明聚乙烯地膜（無色透明地膜，M3）、銀色聚乙烯地膜（銀色地膜，M4）、麻類材料地膜（M5），每個處理3個重復(fù)，隨機排列。每個小區(qū)面積30 m2，株距30 cm×30 cm。辣椒定植后，施肥等日常管理按常規(guī)方法統(tǒng)一進行。

在辣椒采收期間（8月25日）按“S”型采集耕作層（0～30 cm）土壤樣品。每個小區(qū)分別采集5～8個點，去除殘根等雜物后充分混勻，并用無菌塑料袋裝好帶回實驗室。一部分室內(nèi)自然風(fēng)干后過40目篩，用于土壤理化性狀測定；另一部分過10目篩后，置于4℃冰箱保存，用于土壤生物學(xué)性狀分析（其中用于高通量測序分析的樣品在采集后按測序樣品要求即時處理并包裝送檢）。

2016年6月1日至8月25日每天早上10:00，采用WQG-16曲管地溫表讀取不同深度（5、10、15、20 cm）土壤溫度。土壤含水量、pH和有機質(zhì)分別采用稱重法、PHS-3C型精密酸度計和重鉻酸鉀容量法測定。

土壤微生物生物量碳、氮和磷測定采用氯仿熏蒸提取-容量分析法［14］、茚三酮比色法［15］和磷鉬藍比色法［16］。土壤β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶活性測定采用Hayano［17］、Ladd［18］及Tabatabai和Bremner［19］的方法。

1.3 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與多樣性分析

總DNA提取與PCR擴增：采用 OMEGA 土壤提取試劑盒提取總 D N A，用 Q u b i t 2.0 檢測 D N A 濃度，瓊脂糖凝膠檢測 D N A 完整性。每個樣品 3次重復(fù)，將同一樣品的DNA 混合，作為每份土壤樣品的總 D N A。P C R 擴增采用的是1 6 S r R N A 基因中V 3-V 4 高變區(qū)通用引物3 4 1 F(C C TA C G G G N G G C W G C A)和805R(GACTACHVGGGTATCTAATCC)。擴增條件設(shè)置：94℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30s，45℃退火20 s，65 ℃延伸30s，5個循環(huán)；94 ℃延伸20 s，55℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，20個循環(huán)。進一步采用匹配Illumina測序接頭和標(biāo)簽引物擴增，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（cat:SK8131）對DNA 進行回收。回收產(chǎn)物用 Qubit2.0定量，根據(jù)測得的 DNA 濃度將所有樣品按照1∶1 的比例進行混合，用于后續(xù)測序。

高通量測序：16S rRNA 基因的 PCR 產(chǎn)物由北京百邁客生物科技有限公司完成測序，測序儀器為Illumina公司的新一代測序儀Hiseq 2500，測序所得結(jié)果，采用prinseq軟件對reads1、reads2的3端進行質(zhì)控，截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù)，以提高后續(xù)序列融合比率。通過 Flash 軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列。采用prinseq軟件對各個樣品進行去引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列、低質(zhì)量序列。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行計算處理，采用SPSS 19.0軟件進行方差分析，顯著性檢驗采用鄧肯（Duncan）法，不同字母表示在P＜0.05水平具有顯著性差異。使用R語言工具進行微生物多樣性數(shù)據(jù)統(tǒng)計及繪制樣品各分類水平下的群落結(jié)構(gòu)柱形圖和維恩圖。

2 結(jié) 果

2.1 覆蓋地膜對土壤溫度、含水量和pH的影響

表1所示土壤溫度為試驗地夏季（6、7、8月份）每天上午10:00地溫的觀測平均值。由表1可知，隨著土壤深度的增加，覆蓋地膜土壤溫度均呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢，這與外界光照強度以及地膜的保溫作用有關(guān)。其中，覆蓋具有良好透水、透氣效果的麻類材料（M5），土壤溫度和對照相比無顯著差異，而覆蓋透水、透氣性差的聚乙烯類地膜，土壤溫度則顯著升高。覆蓋無色透明地膜，不同深度地溫均顯著高于對照，且在四種地膜中保溫效果最好；覆蓋黑色地膜對不同深度土壤溫度的提升效果顯著高于銀色地膜、麻類材料。

表1 覆蓋不同種類地膜對植椒土壤溫度、含水量和pH的影響Table 1 Effects of mulching on soil temperature, water content, and pH in pepper fields relative to type of the mulching film

與對照相比，覆蓋除麻類材料外的地膜均顯著提高了植椒土壤的含水量，并顯著提高了土壤pH，即聚乙烯類材料地膜更有助于保持土壤水分含量和減緩?fù)寥纏H下降。

2.2 覆蓋地膜對土壤微生物生物量及酶活性的影響

由表2可知，與對照相比，覆蓋不同種類地膜不同程度地提高了植椒土壤的微生物碳、氮、磷。其中，覆蓋不同種類地膜均顯著提高了土壤微生物生物量碳，覆蓋無色透明地膜和麻類材料地膜均顯著提高土壤微生物生物量氮，覆蓋除麻類材料外的地膜均顯著提高了土壤微生物生物量磷。與此同時，覆蓋除麻類材料外的地膜均顯著提高了植椒土壤的β-葡糖苷酶、氨肽酶和磷酸酶活性，提升效果最佳的為無色透明地膜。覆蓋地膜條件下土壤酶活性的變化與土壤溫度的變化趨勢相似。

2.3 覆蓋地膜對土壤細菌群落組成及多樣性的影響

測序共獲得有效序列348 687條，平均長度為422 bp，測序覆蓋率在 82.4%～84.8%。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知不同分組（或樣本）在屬分類水平上的群落結(jié)構(gòu)組成情況（圖1）。未可培養(yǎng)細菌在所有土壤樣品均占據(jù)優(yōu)勢，相對豐度最高的為M1（達53.78%）、最低的為M2（黑色地膜，為40.57%），表明覆膜降低了未可培養(yǎng)細菌的相對豐度。可鑒別的優(yōu)勢菌屬依次為黃桿菌屬、溶桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。其中，覆膜土壤黃桿菌屬的相對豐度顯著大于CK，且M4（銀色地膜）處理最高。M4處理土壤pH顯著高于其他處理（表1），而且覆蓋黑色和無色透明地膜處理土壤的pH亦顯著高于CK，推測土壤酸化可能不利于黃桿菌屬細菌的生存。姜英華等［20］研究發(fā)現(xiàn)溶桿菌對真菌、革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌和線蟲都有突出的拮抗作用。覆膜處理（M3除外）土壤中溶桿菌屬的相對豐度均顯著高于CK，其中M2處理最高，表明遮光環(huán)境或更有利于溶桿菌的生長。芽胞桿菌是一類常見的根際促生細菌，其對促進植物生長和減少病害發(fā)生有積極作用［21］。覆膜處理中M5（麻類材料地膜）處理的芽胞桿菌相對含量最高，表明遮光與透氣的地膜有助于土壤中芽胞桿菌的生存與繁衍。此外，產(chǎn)黃桿菌屬（Rhodanobacter）、鞘氨醇單胞菌屬、硝化螺菌屬（Nitrospira）、產(chǎn)堿桿菌屬、粘細菌屬（Haliangium）、蘚桿菌屬（Bryobacter）等在覆膜條件下均發(fā)生了一定程度的變化，但變化幅度小于黃桿菌屬和溶桿菌屬。

表2 覆蓋不同種類地膜對植椒土壤微生物生物量及酶活性的影響Table 2 Effects of mulching on soil microbial biomass and enzyme activities in pepper fields relative to type of the mulching film

圖1 土壤細菌屬分類水平的組成和相對豐度（a）及在OTU水平的維恩圖（b）Fig. 1 Composition and relative abundance of the soil bacteria at genus level (a) and Venn diagram of the soil bacteria at OTU level (b)

維恩圖可以反映環(huán)境樣品的相似性及重疊情況，由圖1b可知，不同處理土壤樣品的共有OTU值為1 778，占各樣品總OTU的84.4%～88.1%。其中，M1所含的獨立OTU數(shù)值最大為6，占該樣品總OTU的0.29%；而其他樣品所含獨立OTU值分別為（2、0、2、1），占各樣品總OTU的0%～0.10%，均小于對照（M1）。究其原因，可能是CK直接與空氣接觸從而產(chǎn)生土壤細菌與外界環(huán)境細菌之間的相互交換以及黏附于空氣塵埃細菌的沉降有關(guān)；而其他處理由于地膜的物理阻隔作用使覆蓋地膜區(qū)土壤微環(huán)境相對封閉。

微生物群落多樣性特征分析中，C h a o 1、ACE、香農(nóng)指數(shù)越大，說明樣品的物種多樣性越高［22］；由表3可知，Chao1 指數(shù)與香農(nóng)指數(shù)由高到低依次為無色透明地膜、麻類材料地膜、銀色地膜、黑色地膜、CK；ACE指數(shù)由高到低的順序為無色透明地膜、銀色地膜、CK、麻類材料地膜、黑色地膜，表明除覆蓋黑色地膜和麻類材料地膜會使土壤細菌群落中某些細菌種群繁殖較好、在群落中優(yōu)勢度上升而導(dǎo)致ACE指數(shù)下降外，覆蓋銀色和無色透明地膜并沒有導(dǎo)致土壤細菌豐富度指數(shù)ACE下降。

3 討 論

地膜具有調(diào)節(jié)土溫、保持水土、維持土壤結(jié)構(gòu)、防治雜草與病毒病以及防止土壤鹽類積累等作用，而且黑色和銀色地膜提高土溫效果不及透明地膜［8］。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)南方地區(qū)應(yīng)用地膜，其調(diào)節(jié)土溫的效果與上述的研究結(jié)果相一致，即：無色透明地膜提升土溫的效果最為顯著；表明透氣透水性差的聚乙烯類地膜均有助于提升土壤溫度，但覆蓋材料的透光性能亦是左右土壤溫度的一個重要因素。另一方面，聚乙烯類材料地膜覆蓋顯著地減緩了土壤pH的下降，原因可能是聚乙烯類材料地膜透水性能不佳，從而減少了雨水或灌溉水對土壤鹽基陽離子的淋溶，從而減緩了土壤pH的下降。由此推斷，在南方植椒土壤中應(yīng)用不同地膜（尤其是聚乙烯材料地膜）不僅有助于提高土壤溫度與含水量，而且對減緩?fù)寥纏H下降亦具有顯著效果。

表3 覆蓋不同種類地膜對植椒土壤細菌多樣性的影響Table 3 Effect of mulching on soil bacterial diversity in pepper fields relative to type of the mulching film

土壤微生物活性與多樣性的變化能敏感地反映出土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康狀況［23］。其中，土壤酶參與土壤中幾乎所有的有機物質(zhì)和營養(yǎng)元素的循環(huán)［24］，其活性大小不僅能指示土壤生態(tài)系統(tǒng)功能變化的多樣性和穩(wěn)定性［25］，亦是評價土壤健康和肥力水平的重要指標(biāo)［26］。本試驗中，覆蓋聚乙烯材料地膜均顯著提高植椒土壤中β-葡糖苷酶、磷酸酶和氨肽酶活性，這一現(xiàn)象可能與地膜覆蓋處理提高了土壤溫度、土壤含水量以及細菌數(shù)量緊密相關(guān)。土壤微生物生物量同樣是衡量土壤質(zhì)量、維持土壤肥力和作物生產(chǎn)力的一個重要指標(biāo)［27］。與對照相比，覆蓋地膜均不同程度地提高了植椒土壤中的微生物生物量碳、氮、磷，表明南方地區(qū)當(dāng)前應(yīng)用地膜的模式不僅沒有導(dǎo)致土壤質(zhì)量劣化，而且還有助于維護植椒土壤肥力。

基于高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，覆蓋不同地膜還有利于提高植椒土壤細菌豐富度和多樣性指數(shù)，尤其以無色透明地膜的提升效果尤為顯著，其原因可能與無色透明地膜顯著提高土壤溫度、含水量和減緩?fù)寥纏H下降的作用緊密相關(guān)。根據(jù)位于北方地區(qū)的研究中發(fā)現(xiàn)，地膜覆蓋顯著影響土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，其影響效果主要通過對土壤有機碳、總氮、有效磷、pH以及土壤水分的間接作用實現(xiàn)的［13］。本試驗中，南方地區(qū)應(yīng)用地膜覆蓋，同樣不同程度地具有影響土壤微生物豐富度和多樣性的作用效果，尤其是無色透明地膜，呈現(xiàn)影響土壤微生物豐富度和多樣性的顯著效果。其原因可能與無色透明地膜顯著提高了土壤溫度，水分含量以及減緩?fù)寥纏H的下降緊密相關(guān)。另一方面，表明我國南、北方地區(qū)應(yīng)用地膜對土壤微生物多樣性的影響具有相似的作用效果。此外，屬分類水平上，黃桿菌屬、溶桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽胞桿菌屬和未可培養(yǎng)細菌屬細菌均為南方地區(qū)覆蓋地膜植椒土壤中的優(yōu)勢菌屬。已有的研究證實，溶桿菌屬的大多數(shù)細菌對病原真菌、G＋細菌、線蟲和綠藻均有突出的拮抗作用［28］；芽胞桿菌屬細菌對促進誘導(dǎo)作物系統(tǒng)抗性和促進植物生長有積極作用［29］；鞘氨醇單胞菌屬的細菌對于土壤中多環(huán)芳烴的降解起到一定的調(diào)控作用［30］；產(chǎn)堿桿菌屬細菌（H16）參與土壤中氫化酶的合成調(diào)節(jié)，對土壤氫循環(huán)起到重要的作用［31］。

雖然在97%相似度的聚類分析還未能完全查明土壤細菌遺傳多樣性，但是基于高通量測序深度基本能夠反映該區(qū)域細菌群落的種類和結(jié)構(gòu)，完全可以定量比較整個群落組成和多樣性的相對差異［32］。本試驗的結(jié)果表明，南方地區(qū)當(dāng)前辣椒實際生產(chǎn)中，應(yīng)用不同地膜，尤其覆蓋以聚乙烯為原料的黑色、銀色或無色透明地膜不僅有助于提高土壤溫度和保持水土、減緩?fù)寥浪峄M程，維護土壤肥力，提高植椒土壤中細菌豐富度和多樣性指數(shù)，而且還助于形成以溶桿菌屬、芽胞桿菌屬細菌等為優(yōu)勢菌屬的土壤環(huán)境，這些具有促進植物生長，維護土壤健康作用的優(yōu)勢菌屬將有利于生態(tài)防控植椒菜園土傳病害的發(fā)生與蔓延。

4 結(jié) 論

當(dāng)前南方地區(qū)辣椒實際生產(chǎn)中，覆蓋不同種類地膜（尤其以聚乙烯為原料的無色透明地膜、黑色地膜和銀色地膜）不僅有助于提高辣椒菜園耕

作層土壤溫度與含水量，而且對減緩南方地區(qū)植椒土壤pH的下降、提高土壤微生物生物量以及酶活性具有顯著的效果。同時，應(yīng)用地膜還有助于提高植椒土壤中細菌的豐富度（Chao1）和多樣性（Shannon）指數(shù)。另一方面，黃桿菌屬、溶桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽胞桿菌屬細菌等一些具有生防作用的益生細菌是覆蓋地膜植椒土壤中的優(yōu)勢菌屬，表明當(dāng)前南方地區(qū)辣椒生產(chǎn)中應(yīng)用地膜不僅沒有導(dǎo)致植椒土壤質(zhì)量劣化，而且還有助于提高土壤肥力和保持土壤健康。