牙齦卟啉單胞菌內(nèi)化牙周膜干細胞抑制成骨分化的能力

潘春玲，呂雪雯，王宏巖，寇育榮，潘亞萍

（中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院牙周科，遼寧省口腔醫(yī)學研究所牙周病研究室，中國醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院中心實驗室，遼寧省口腔疾病重點實驗室，遼寧省口腔疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學研究中心，沈陽 110002）

牙周病是牙周支持組織的慢性炎癥性疾病。在我國牙周病患病率呈高發(fā)趨勢，是患病率最高的口腔疾病。牙齦卟啉單胞菌 （Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis） 是牙周紅色復合體的組成成員，與牙周支持組織破壞關系密切［1］。牙周膜干細胞是一類具有多項分化能力的細胞，在牙周組織中發(fā)揮維持組織更新和修復損傷的重要作用，已被證實是牙周組織再生的重要種子細胞［2］。目前臨床上任何治療方法獲得的牙周組織再生，尤其是骨組織的修復再生，都非常有限。堿性磷酸酶 （alkaline phosphatase，ALP） 是一種非特異性水解酶，是成骨細胞標志性因子，ALP水平的升高與局部鈣化活性增高以及活躍的骨改建密切相關［3］。Runx相關的轉(zhuǎn)錄因子2 （Runx2） 在調(diào)節(jié)干細胞分化為成骨細胞中發(fā)揮重要作用，Runx2的表達升高能夠促進成骨細胞特異性基因的表達并啟動礦化［4］。骨鈣素 （osteocalcin，OCN） 是成骨細胞合成和分泌的一種非膠原骨基質(zhì)蛋白，OCN具有與鈣離子的高親和力和連接羥基磷灰石的能力，被認為是骨轉(zhuǎn)換的有效標志物，在調(diào)控骨基質(zhì)礦化方面起促進作用［5］。本研究通過觀察P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞對其骨向分化能力的影響，檢測ALP、Runx2和OCN的表達，為應用牙周膜干細胞修復炎性微環(huán)境中破壞的牙周組織提供理論指導和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細菌培養(yǎng)

P. gingivalis ATCC 33277 （中國醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院口腔生物教研室提供） 于含5%羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K1的胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基固體培養(yǎng)。液體培養(yǎng)24 h，離心收集細菌，PBS洗滌后，重懸于無抗生素細胞培養(yǎng)基中。紫外分光光度計測量600 nm吸光度值，調(diào)節(jié)細菌菌液濃度為1×109/mL后備用。

1.2 組織塊法培養(yǎng)原代牙周膜細胞、有限稀釋法克隆純化牙周膜干細胞

選取因正畸治療需要拔除的前磨牙和第三磨牙30顆，均經(jīng)患者本人及監(jiān)護人同意，并簽署知情同意書?；颊邿o全身系統(tǒng)性疾病、家族遺傳病和特殊服藥史，臨床檢查牙齒無牙體及根尖周病變。牙周膜干細胞培養(yǎng)方法參見文獻［6］。收集臨床上拔除的牙齒，立即置于含PBS的離心管中，大量PBS沖洗后，無菌刀片刮取牙根中部的牙周膜組織，眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，接種于含15%血清DMEM培養(yǎng)基的6孔板中培養(yǎng)，每周換液2次，當細胞生長達70%～80%匯合時，消化并調(diào)整密度為10/mL，接種于96孔板，每孔100 μL。過夜培養(yǎng)，挑選單細胞孔標記，待細胞形成克隆后，消化并將多個單克隆來源的細胞懸液混合擴大培養(yǎng)。選取第3～7代的牙周膜干細胞用于本研究。

1.3 牙周膜干細胞免疫組化染色和生長曲線測定

牙周膜干細胞生長匯合約為80%時，胰酶消化細胞，并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1.5×104/mL，加入100 μL細胞懸液至96孔板中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組5孔，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)10 d。每天取1板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，測定450 nm處的吸光度值。

制備牙周膜干細胞爬片，PBS 沖洗3遍，3% H2O2孵育10 min，PBS 沖洗，滴加鼠抗人波形蛋白單克隆抗體和鼠抗人角蛋白單克隆抗體，37 ℃ 孵育 2 h，按照DAB試劑盒說明書染色，蘇木素復染，梯度乙醇逐級脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察細胞的染色情況。

1.4 茜素紅染色觀察P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞成骨分化的能力

牙周膜干細胞融合度達到80%后，按照感染復數(shù)20∶1，P. gingivalis ATCC 33277與牙周膜干細胞共同培養(yǎng)2 h，換液洗去細胞外未黏附細菌，換成含300 μg/mL慶大霉素和200 μg/mL甲硝唑的新鮮成人骨髓間質(zhì)干細胞成骨誘導分化完全培養(yǎng)基 （賽業(yè)生物科技有限公司）。每隔3 d重復上述步驟，成骨誘導2周后，用茜素紅進行染色。設立未成骨誘導分化完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞為空白對照組，設立成骨誘導分化完全培養(yǎng)基培養(yǎng)而未加細菌感染的細胞為陽性對照組。

1.5 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞對ALP活性的影響

按照ALP試劑盒 （碧云天生物技術公司） 操作步驟，采用對硝基苯磷酸作為酶底物來檢測ALP活性。成骨誘導培養(yǎng)第7和14天時棄除培養(yǎng)液，裂解牙周膜干細胞，以12 000 r/min、4 ℃離心15 min收集的細胞裂解產(chǎn)物，96孔板中每孔加入50 μL底物緩沖液和50 μL裂解液，37 ℃孵育10 min后，加入100 μL反應終止液，用酶標儀測量405 nm處吸光度。根據(jù)繪制的ALP標準曲線，計算相應的ALP濃度。

1.6 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞對成骨分化基因的影響

成骨誘導培養(yǎng)第 7和14天時棄除培養(yǎng)液，PBS沖洗3遍，Trizol裂解細胞，提取樣品總 RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒（寶日醫(yī)生物技術有限公司） 將總 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。OCN 引物：上游5'-GCAATAAGGTAGTGAACAGACT CC-3'，下游5'-CCATAGATGCGTTTGTAGGCGG-3'。Runx2 引物：上游5'-CCTGAACTCTGCACCAAGTCC-3'，下 游5'-TCATCTGGCTCAGATAGGAGGG -3'。β-actin引物：上游5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'，下游5'-TCGCTCCTGGAAGATGG-3'。采用TB GreenTMPremix Ex TaqTM試劑盒 （日本TaKaRa公司） 實時 PCR擴增 （美國ABI公司），測定OCN和Runx2基因的相對含量。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 牙周膜干細胞的培養(yǎng)、純化和鑒定

牙周膜細胞大約5 d左右從組織塊邊緣游出，20 d左右細胞融合度達80%，細胞以組織塊為中心呈放射狀、旋渦狀單層生長，中心部較密，外部稀疏，細胞較大，長梭形突起相互連接，有限稀釋克隆傳代后細胞生長狀態(tài)良好 （圖1A）。使用CCK-8試劑盒檢測牙周膜干細胞的增殖活力，繪制的牙周膜干細胞生長曲線呈反“S”形，1～3 d細胞生長緩慢，4～8 d細胞快速生長，9 d達到平臺期 （圖1B）。免疫組化染色后鏡下可見波形蛋白染色陽性，細胞質(zhì)染成棕黃色，細胞核染成藍色；角蛋白染色陰性，細胞核染成藍色，具有中胚層來源的成纖維細胞的特征，且無上皮細胞污染 （圖1C、1D）。

圖1 牙周膜干細胞的培養(yǎng)、純化和鑒定Fig.1 Culture，purification，and identification of periodontal ligament stem cells

2.2 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞抑制成骨分化的能力

茜素紅染色觀察到未經(jīng)成骨礦化誘導的牙周膜干細胞沒有紅色礦化結(jié)節(jié)的形成，經(jīng)成骨礦化誘導的陽性對照組和內(nèi)化組牙周膜干細胞均可形成礦化結(jié)節(jié)。同時發(fā)現(xiàn)，陽性對照組體外形成的礦化結(jié)節(jié)大而多，而內(nèi)化組形成的礦化結(jié)節(jié)少而稀疏（圖2），表明牙周膜干細胞經(jīng)過成骨誘導后可以形成礦化結(jié)節(jié)，P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化后可以抑制牙周膜干細胞成骨分化的能力。

2.3 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞降低ALP活性

圖2 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞抑制成骨分化的能力 ×20 Fig.2 P. gingivalis invasion-mediated inhibition of osteogenic differentiation ability in periodontal ligament stem cells ×20

未經(jīng)成骨誘導的牙周膜干細胞，ALP活性在第7和14天無明顯的變化。陽性對照組和內(nèi)化組牙周膜干細胞隨時間的延長，ALP活性升高。與空白對照組相比，陽性對照組和內(nèi)化組牙周膜干細胞ALP活性升高，且內(nèi)化組牙周膜干細胞ALP活性低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） （圖3）。表明牙周膜干細胞經(jīng)過成骨誘導后，ALP活性升高，P.gingivalis ATCC 33277內(nèi)化后可以抑制牙周膜干細胞ALP活性。

圖3 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞成骨誘導后對ALP活性的影響Fig.3 ALP activity after osteogenic induction in periodontal ligament stem cells invaded by P. gingivalis

2.4 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞對Runx2和OCN基因表達的影響

空白對照組牙周膜干細胞Runx2基因表達在第7和14天無明顯變化。與空白對照組相比，陽性對照組和內(nèi)化組牙周膜干細胞Runx2基因表達升高，且內(nèi)化組牙周膜干細胞Runx2基因表達低于陽性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05）。陽性對照組和內(nèi)化組牙周膜干細胞隨誘導時間的延長Runx2基因表達升高，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） （圖4A）。

空白對照組牙周膜干細胞OCN基因表達在第7和14天無明顯變化，而陽性對照組和內(nèi)化組牙周膜干細胞OCN基因表達升高，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05）。成骨誘導第7天陽性對照組和內(nèi)化組OCN基因表達無統(tǒng)計學差異 （P ＞ 0.05）；在成骨誘導第14天，內(nèi)化組OCN基因表達明顯低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05） （圖4B）。表明牙周膜干細胞經(jīng)過成骨誘導后，Runx2和OCN基因表達升高，P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化后可以抑制牙周膜干細胞Runx2和OCN基因表達。

3 討論

圖4 P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞對Runx2和OCN基因表達的影響Fig.4 Runx2 and OCN expression after osteogenic induction in periodontal ligament stem cells invaded by P. gingivalis

牙周病是細菌感染性疾病，其臨床表現(xiàn)為牙周支持組織不可逆性破壞，最終導致牙齒松動和脫落，是成人失牙的最主要原因。牙周治療目標是促使被炎癥破壞的牙周支持組織再生和重建。2004年，SEO等［7］利用單細胞克隆技術，成功分離、鑒定牙周膜干細胞，其具有克隆能力、高增殖能力及形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構的特性，實現(xiàn)組織學上真正的牙周組織修復和再生，成為牙周組織工程研究的種子細胞。因此，在牙周炎癥發(fā)生過程中，探索P. gingivalis內(nèi)化牙周膜干細胞對成骨分化的影響，采取相應的對策，將對牙周炎的損傷修復具有重要意義。

克隆形成和多向分化能力是干細胞的主要特征。本研究通過組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)牙周膜細胞，經(jīng)過有限稀釋在體外擴增培養(yǎng)后，細胞呈集落樣增長，在形態(tài)學上與其他間充質(zhì)干細胞一樣，呈現(xiàn)長梭形、旋渦狀單層生長，生長狀態(tài)良好。牙周膜干細胞的生長曲線具有慢周期性的生物學特性，免疫組化染色后鏡下可見波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性，具有中胚層來源的成纖維細胞的特征。通過茜素紅染色觀察到牙周膜干細胞體外經(jīng)成骨誘導后能夠分化為成骨細胞，形成礦化結(jié)節(jié)，證實其干細胞的特征，為進一步的實驗研究奠定基礎。

近年來許多學者對P. gingivalis毒力因子對牙周膜干細胞的影響進行了深入研究，然而關于P. gingivalis活菌對牙周膜干細胞的影響鮮有研究，活菌感染更能真實的反映臨床疾病的發(fā)生發(fā)展過程。研究［8］發(fā)現(xiàn)，當P. gingivalis低感染復數(shù)長期感染人永生化口腔上皮細胞后能夠促進細胞增殖，并且具有腫瘤樣特征。本研究中在20∶1低感染復數(shù)下，牙周膜干細胞的增殖能力無明顯變化。此外，研究證實P.gingivalis脂多糖能夠通過Notch1信號通路，抑制成骨細胞的骨向分化潛能［9］。當干細胞分化為成骨細胞時，Runx2、OCN、ALP均為干細胞成骨相關因子，分別在干細胞不同成骨時期高表達［10］。Runx2是成骨細胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子，其調(diào)控成骨基因的表達并誘導成骨細胞分化和骨形成。OCN由成骨細胞合成和分泌，主要在礦化形成期出現(xiàn)，被認為是成骨細胞向礦化期分化的標志之一。在骨化和成骨過程中ALP與骨的鈣化相互協(xié)調(diào)，鈣與ALP產(chǎn)生的磷酸結(jié)合成磷酸鈣沉積于骨中。本研究表明，P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化組牙周膜干細胞礦化結(jié)節(jié)少而稀疏，ALP活性明顯低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義。同時P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化組牙周膜干細胞Runx2和OCN基因表達低于陽性對照組，差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜ 0.05）。結(jié)果表明，P. gingivalis ATCC 33277內(nèi)化牙周膜干細胞后可抑制其成骨分化的能力。

近年來干細胞所處的微環(huán)境越來越受到研究者的關注，如何改善或恢復由感染而引起的牙周膜干細胞成骨能力下降成為牙周再生的一個新思路。長期慢性感染微環(huán)境對干細胞增殖和分化的影響尚需深入的研究，探索P. gingivalis內(nèi)化牙周膜干細胞影響骨向分化的機制，采取相應的措施，對防治牙周炎癥具有重要意義。