鳳丹種莢提取物抗菌活性研究

趙國棟

摘要 ? ?比較鳳丹種莢水提取物和乙醇提取物的抗菌活性，對鳳丹種莢的水提取物和乙醇提取物進行體外抗細菌和真菌的活性試驗，測定比較其最小抑菌濃度（MIC）。結果表明，2種提取物對所選取的4種細菌均具有一定的抑菌效果，乙醇提取物的抑菌活性強于水提取物。2種提取物未表現(xiàn)出抑制真菌黑曲霉的活性，其最小抑菌濃度均大于2 mg/mL。由此說明，鳳丹種莢提取物對細菌有一定的抑菌效果，具有一定的開發(fā)應用價值。

關鍵詞 ? ?牡丹;鳳丹;種莢;抗菌活性;最小抑菌濃度

中圖分類號 ? ?S565.9;R285.5 ? ? ? ?文獻標識碼 ? ?A

文章編號 ? 1007-5739（2019）13-0200-02 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）

Study ?on ?Antibacterial ?Activity ?of ?Pod ?Extracts ?of ?Paeonia ?ostii

ZHAO Guo-dong 1，2

（1 Luoyang National Peony Garden，Luoyang Henan 471011; 2 National Peony Gene Bank）

Abstract ? ?To compare the antibacterial activity of water extracts and ethanol extracts from seed pods of Paeonia ostii，the in vitro antibacterial and antifungal experiments on water extracts and ethanol extracts from seed pods of Paeonia ostii were conducted，and the minimum bacteriostatic concentrations（MIC） were determined and compared. The results showed that the two extracts both had inhibitory effects on the 4 kinds of bacteria，and the antibacterial activity of ethanol extracts were better than the water extracts. The two extracts showed no inhibition activity on fungal Aspergillus niger，and their MIC was more than 2 mg/L. In summary，the extracts from seed pod of Paeonia ostii has antibacterial effect，and it has potential value in developed and application.

Key words ? ?Paeonia suffruticosa Andr.;Paeonia ostii;seed pod;antibacterial activity;minimum bacteriostatic concentration

植物是生物活性化合物的天然寶庫。國外學者Wilkins和Board曾經(jīng)報道，有1 389種植物可以作為殺菌劑、防腐劑的提取來源[1]，約2 400種植物具有控制有害生物活性的作用[2]，而植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物超過400 000種[3]，其中多數(shù)化合物如多酚、黃酮、生物堿、萜烯類和有機酸類均具有抗菌性或殺蟲活性。然而，目前研究開發(fā)的植物種類僅僅占比10%，大量潛在的具有活性的植物種類或材料亟待開發(fā)利用。

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）為芍藥科（Paeoniaceae）芍藥屬（Paeonia）牡丹組落葉灌木，原產(chǎn)中國，是我國十大名花之首，素有“百花之王，國色天香”的美譽，歷來為世人所喜愛。牡丹全身都是寶，其根、皮、花、葉、種子均可被利用[4]。2011年，國家衛(wèi)生部批準鳳丹（Paeonia ostii T.Hong et J.X.Zhang）牡丹和紫斑（Paeonia rockii T.Hong et J.J.Li et D.Y.Hong）牡丹籽油作為新資源食品。牡丹籽油含有豐富的不飽和脂肪酸，具有重要的保健價值和藥用價值[5]。油用牡丹作為新興木本油料作物，已被列入國家林業(yè)“十三五”發(fā)展規(guī)劃重點林業(yè)工程，截至2016年，全國已發(fā)展到6.67萬hm2以上。

油用牡丹果實是蓇葖果，一般每個蓇葖果有3～5個果莢，成熟的牡丹果莢外殼比較致密堅硬。牡丹種莢作為油用牡丹的副產(chǎn)品，隨著油用牡丹種植規(guī)模的擴大，其產(chǎn)量逐步增加。根據(jù)測算，每生產(chǎn)100 kg牡丹籽會產(chǎn)出50～60 kg種莢。然而，在生產(chǎn)過程中大量的牡丹種莢被廢棄，造成了資源浪費。

為了變廢為寶，開展了種莢的綜合利用。本研究以油用牡丹鳳丹種莢為原料，研究其提取物的抗菌活性，探討其作為食品防腐劑的可能性，以期為鳳丹種莢資源的綜合利用提供依據(jù)[6-7]。

1 ? ?材料與方法

1.1 ? ?試驗材料

供試油用牡丹鳳丹果莢采自國家牡丹基因庫油用牡丹圃，系自育的八年生鳳丹，8月上旬蓇葖果開裂后采收，果莢內(nèi)種子脫離后外殼用于提取和抗菌試驗[8-9]。

試驗菌種為大腸桿菌Escherichia coli（CCAM080173）、金黃色葡萄球菌Staphyloccocus aureus（CCAM080177）、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis（CMCC63501）、黑曲霉Aspergillus niger（CCAM080002）。

1.2 ? ?儀器與試劑

供試儀器：MP10001電子天平（上海恒平科學儀器有限公司生產(chǎn)）;LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）;SA-JZ多功能超凈工作臺（上海稼豐園藝用品有限公司生產(chǎn)）;QTSXR10260超聲波清洗儀（天津市瑞普電子儀器公司生產(chǎn)）;PGX-280A-22H型生化培養(yǎng)箱（寧波萊?？萍加邢薰旧a(chǎn)）。

供試試劑：鹽酸四環(huán)素、蛋白胨、瓊脂（Sigma）;二甲基亞砜DMSO、氯化鈉以及蔗糖（上海浩洋生物科技有限公司生產(chǎn)）。

1.3 ? ?鳳丹種莢粗提物制備

將鳳丹種莢漂洗之后自然晾干剪碎，于60 ℃恒溫箱中烘干至恒重，用中藥粉碎機粉碎后過20目篩，準確稱取粉末40 g，平均分成2份。一份加入5倍體積的蒸餾水浸提24 h，并每隔2～3 h攪拌混勻1次，浸提之后過濾2次，上清液于8 000 r/min離心15 min，去除沉淀并濃縮，滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆?另外一份以乙醇作為提取溶劑，濾渣重復提取2次，合并濾液，減壓旋轉蒸發(fā)溶劑，濃縮后凍干12 h，得乙醇粗提物[10-11]。

1.4 ? ?提取物樣品的制備

稱取預先干燥后的鳳丹種莢醇提物和水提物，稱定后分別用5% DMSO溶解配制成8 mg/mL溶液備用，并且在每次取用前均用超聲充分分散均勻。

1.5 ? ?菌懸液及孢子懸液的配制

將各細菌菌種接種于LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃?zhèn)鞔囵B(yǎng)2次進行活化，挑取活化好的細菌用無菌生理鹽水配制成菌懸液，按10倍濃度梯度進行稀釋后進行平板菌落計數(shù)，計算出原菌懸液的濃度并在此基礎上稀釋成1×108 CFU/mL菌懸液備用;真菌采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)至產(chǎn)生大量孢子，再用無菌生理鹽水將菌絲上的孢子洗脫后配制成菌懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，并稀釋成1×106個/mL孢子懸液備用[12-13]。

1.6 ? ?抗細菌活性的測定

1.6.1 ? ?最小抑菌濃度（MIC）的測定。取各個極性部位提取物溶液100 μL采用2倍稀釋法用無菌水稀釋成一系列濃度梯度。取1 mL的1×108 CFU/mL各細菌菌懸液加入至9 mL的LB液體培養(yǎng)基中混勻得相應的培養(yǎng)基菌懸液，在每管中分別加入100 μL培養(yǎng)基菌懸液，各管中提取物質量濃度依次為2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，以無菌水為空白對照，置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察，以目視無菌生長的孔對應最低濃度為最小抑菌濃度。

1.6.2 ? ?牛津杯法測定對細菌抑制活性。取制備好的細菌懸液100 μL，加入到含LB固體培養(yǎng)基的平皿表面，用涂布棒涂布均勻。等距放上4個滅菌的牛津杯（10.0 mm×7.8 mm×6.0 mm）于含菌平板上，分別加入樣液100 μL，以50 μg/mL鹽酸四環(huán)素為陽性對照將平板置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)，測量抑菌圈直徑的大小，其中枯草芽孢桿菌培養(yǎng)18 h、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24 h后測量結果。每個提取物平行做3個重復。

1.7 ? ?抗真菌活性測定

取各提取物溶液100μL采用2倍稀釋法用無菌水稀釋成一系列濃度梯度。取1 mL的1×106個/mL的各孢子懸液加入至9 mL的PDB培養(yǎng)基中，混勻得相應的培養(yǎng)基菌懸液，在每管中分別加入100 μL培養(yǎng)基孢子懸液，各管中提取物質量濃度依次為2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，以無菌水為空白對照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后觀察菌絲生長情況，中心無菌絲生長的孔對應的最低濃度為最小抑菌濃度（MIC）。

2 ? ?結果與分析

2.1 ? ?不同提取物對細菌的抑菌活性

最小抑菌濃度（MIC）的測定結果如表1所示。從結果來看，鳳丹種莢乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制活性均為0.5 mg/mL;鳳丹種莢水提物具有一定的抑菌活性，對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為1.0 mg/mL，對大腸桿菌的最小抑菌濃度為為2.0 mg/mL。

牛津杯法測定對細菌具有抑制活性，陽性對照藥物50 μg/mL鹽酸四環(huán)素顯示出了對枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制活性，抑菌圈直徑為（10.70±0.50）mm;試驗測試鳳丹種莢水提物未有明顯的抑菌圈，抑菌直徑為（0.07±0.00）mm;鳳丹種莢乙醇提物在8 mg/mL濃度下表現(xiàn)出微弱的抑菌活性，其抑菌圈直徑為（1.27±0.00）mm。

2.2 ? ?不同提取物對真菌的抑菌活性

對鳳丹種莢乙醇提取物和水提取物抗食品腐敗真菌黑曲霉活性進行測定，結果發(fā)現(xiàn)，測試的樣本均沒有表現(xiàn)出抑制真菌孢子萌發(fā)的活性，2種提取物對黑曲霉的最小抑菌濃度（MIC）均大于2 mg/mL。

3 ? ?結論與討論

鳳丹是油用牡丹主要推廣栽培的種類。本文以枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為供試細菌，研究了牡丹種殼提取物對食品腐敗相關的細菌和真菌的抑制活性，結果表明，牡丹種莢乙醇提取物和水提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有一定的抑菌活性，其中乙醇提取物的抑菌活性強于水提物。采用牛津杯法測定牡丹種莢提取物對細菌的抑制活性，在鳳丹種莢醇提物8 mg/mL濃度下體現(xiàn)出了微弱的抑菌活性，其抑菌圈直徑為（1.27±0.00）mm。2種提取物對食品腐敗真菌黑曲霉均沒有抑菌活性。

本試驗僅對鳳丹種莢乙醇萃取相、水萃取相進行抑菌活性分析，尚未開展其他溶劑萃取相的抑菌活性分析，其活性成分有待進一步分析鑒定。本研究可為鳳丹種莢的綜合利用提供數(shù)據(jù)支撐。

4 ? ?參考文獻

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