流式細(xì)胞術(shù)建立甘肅地區(qū)學(xué)齡前漢族兒童外周血淋巴細(xì)胞亞群相對計數(shù)的正常參考值范圍

王文第 毛寶宏 王晶晶 劉月芬 王 劍 王燕俠

淋巴細(xì)胞是人體免疫系統(tǒng)的重要構(gòu)成部分。許多免疫相關(guān)的兒科疾病的診斷與治療都涉及淋巴細(xì)胞亞群的檢測。但是，目前國際上尚無兒童淋巴細(xì)胞亞群參考區(qū)間的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，國內(nèi)多數(shù)實驗室均采用國外試劑說明書或國外參考文獻(xiàn)提供的參考范圍出具報告單[1,2]。許多研究表明，淋巴細(xì)胞亞群的參考值與被檢測者的年齡、性別、民族和地區(qū)等因素相關(guān)[3-7]。因此，使用國外的淋巴細(xì)胞亞群參考值范圍對我國兒童疾病狀態(tài)下的免疫功能進(jìn)行評估，可能造成一定偏差，有必要建立本地兒童分年齡段和性別相應(yīng)的參考范圍。本研究旨在通過流式細(xì)胞術(shù)建立甘肅地區(qū)學(xué)齡前健康兒童淋巴細(xì)胞亞群的正常參考范圍，為臨床診斷提供參考依據(jù)。

1 方法

1.1 倫理 本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院(我院)倫理委員會審核通過(2017院倫審研第14號)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) ①2018年1月31日至2019年1月30日在我院行鞘膜積液、疝、血管瘤等手術(shù)(疾病類型均對機體免疫功能影響不大)或常規(guī)體檢的0～7歲漢族健康兒童；②家長同意參加本研究并簽署知情同意書。

1.3 排除和剔除標(biāo)準(zhǔn) ①患心腦血管疾病：通過病史描述(如是否有頭痛、頭暈、心悸、氣短、無力等癥狀)判斷。②血常規(guī)異常：通過血常規(guī)報告判斷。③肝、腎功能異常：手術(shù)患兒通過肝、腎功能檢查報告判斷；健康體檢兒童部分有肝、腎功能報告，部分通過門診醫(yī)師工作站中的病史描述判斷。④在進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞群檢測的3周內(nèi)存在感染：通過病史描述和血常規(guī)WBC判斷。⑤有先天性免疫缺陷疾?。焊鶕?jù)淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果，剔除淋巴細(xì)胞亞群明顯異常及不符合公式T%+B%+NK%=100%±5%和Th%+Ts%=T%±5%的樣本。

1.4 年齡分組 參考文獻(xiàn)[8]，分為新生兒組、嬰兒組、幼兒組和學(xué)齡前組。

1.5 淋巴細(xì)胞亞群檢測方法 手術(shù)患兒在術(shù)前檢查或術(shù)后復(fù)查時采集血液樣本，體檢兒童在體檢時采集血液樣本。采靜脈血2 mL(EDTA抗凝)，于24 h內(nèi)完成檢測。 采用四色免洗試劑MultiTestTMIMK Kit和FACSCalibur流式細(xì)胞儀(均為美國BD公司產(chǎn)品)，按照試劑說明書進(jìn)行檢測。每個全血標(biāo)本標(biāo)記2支流式細(xì)胞儀專用試管，分別加入20 μL MultiTest CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC和20 μL MultiTest CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC于試管底部；將100 μL EDTA-K2抗凝全血加入各管底部，充分震蕩混合，避光孵育30 min；向各管中加入500 μL MultiTest溶血素(1×)，震蕩混勻后室溫避光孵育15 min；加入PBS 1 mL，離心5 min，棄上清；加入PBS 500 μL，混勻后上機。使用MultiSET軟件自動獲取淋巴細(xì)胞亞群相對計數(shù)結(jié)果。

1.6 質(zhì)量控制 ①我院實驗室使用的流式細(xì)胞儀通過國家衛(wèi)健委臨床檢驗中心室間質(zhì)量評價；②每次樣品檢測前使用BD公司專用四色熒光校準(zhǔn)微球進(jìn)行儀器校準(zhǔn)；③所有檢測由同一位檢驗師完成，數(shù)據(jù)分析由王文第和毛寶宏共同完成。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 非正態(tài)分布變量，用百分位數(shù)法(P2.5、P50、P97.5)獲得正常參考值的范圍，多組間比較用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩組比較用Wilcoxon秩和檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 圖1顯示，研究對象篩選流程，792名0～7歲漢族兒童進(jìn)入本文分析，男472名，女320名，新生兒組174名、嬰兒組216名、幼兒組170名、學(xué)齡前組232名，來源手術(shù)人群623例，健康體檢人群169例(表1)。

圖1 研究對象篩選流程圖

表1 792名甘肅漢族兒童的一般情況

2.2 外周血淋巴細(xì)胞亞群在不同性別、不同年齡組兒童之間的比較 表2顯示，①不同性別之間比較，新生兒組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義，嬰兒組CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞百分比和CD4+/CD8+比值差異有統(tǒng)計學(xué)意義；學(xué)齡前組T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞百分比差異有統(tǒng)計學(xué)意義；②男、女各年齡組組間整體比較，T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞百分比，CD4+/CD8+差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表2 792名甘肅省漢族兒童外周血淋巴細(xì)胞亞群分布[中位數(shù)(P2.5，P97.5)]

2.3 外周血淋巴細(xì)胞亞群在各年齡組的分布趨勢 圖2顯示，隨著年齡的增加，男女兒童淋巴細(xì)胞亞群百分比整體的變化趨勢不同。T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞百分比隨年齡增長呈降低趨勢，男女童降低趨勢相近；CD8+T細(xì)胞百分比隨年齡增長呈升高趨勢，女童更明顯；B細(xì)胞百分比在1歲前呈上升趨勢，之后呈降低趨勢，女童的變化趨勢較為緩和；NK細(xì)胞百分比的變化與B細(xì)胞相反，在1歲內(nèi)降低，而后升高，男童變化趨勢更明顯。

圖2 男女兒童各年齡組淋巴細(xì)胞亞群百分比變化趨勢

3 討論

國內(nèi)外對于健康成年人淋巴細(xì)胞亞群的研究表明，淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果存在年齡、性別、民族和地域的差異[1,14,15]。由于兒童的免疫系統(tǒng)是逐漸成熟的過程，淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)在兒童不同生長發(fā)育階段會表現(xiàn)出一定的差異[16]。

本研究結(jié)果顯示，各年齡段多項淋巴細(xì)胞亞群指標(biāo)存在性別差異。這與肖婧等[6]研究中592名中國漢族健康兒童(28 d至12 歲)外周血淋巴細(xì)胞亞群的分布特點類似。本研究CD4+、B細(xì)胞百分比在各年齡組間均女童高于男童，與林珊等[5]研究結(jié)果相反。淋巴細(xì)胞亞群在男女性別間產(chǎn)生差異可能是由于基因遺傳和內(nèi)分泌的不同導(dǎo)致不同性別可在童年時期形成不同的免疫力。本研究男女兒童各年齡組間分析顯示，總體上所有淋巴細(xì)胞亞群在各年齡組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義，男女兒童淋巴細(xì)胞亞群在多個年齡組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，這與林珊等[5]、肖婧等[6]研究結(jié)果一致；新生兒組T細(xì)胞、CD4+百分比及CD4+/CD8+比值明顯高于其他組，與林珊等[5]的研究結(jié)果一致；且新生兒期以后各年齡段T細(xì)胞百分比相對穩(wěn)定，與Kam等[12]和肖婧等[6]的研究結(jié)果一致。由于新生兒自身免疫功能尚未發(fā)育完全的生理特點，本研究分析了174例新生兒的淋巴細(xì)胞亞群百分比，與肖婧等[6]的研究不同。本研究發(fā)現(xiàn)，CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值隨年齡增長呈降低趨勢，CD8+T細(xì)胞隨年齡增長呈升高趨勢，與大多數(shù)國內(nèi)外研究一致；B細(xì)胞在1歲前升高，而后降低，NK細(xì)胞變化趨勢恰好與B細(xì)胞相反，這與Kam等[12]和林珊等[5]的研究結(jié)果一致。

圖3顯示，本文結(jié)果與美洲[1]、歐洲[10]、非洲[11]和中國香港[12]比較兒童淋巴細(xì)胞亞群百分比、隨年齡段的變化趨勢基本一致，數(shù)值存在一定差異。與美洲[1]、歐洲[10]和非洲[11]兒童相比，甘肅漢族兒童T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞百分比較高，B細(xì)胞百分比較低，表明種族影響淋巴細(xì)胞亞群分布。與中國香港[12]兒童相比，甘肅地區(qū)的漢族兒童CD4+T細(xì)胞百分比較高，CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞百分比較低，顯示同一國家不同區(qū)域的淋巴細(xì)胞亞群亦存在差異，這可能與環(huán)境和生活習(xí)慣等因素有關(guān)。

圖3 不同人群淋巴細(xì)胞亞群百分比隨年齡增長變化趨勢

注 w：周；m：月；y：歲

因此，不同地區(qū)應(yīng)建立各自各年齡組及性別組的參考值。但是，由于兒童志愿者的招募及標(biāo)本采集較為困難，使用流式細(xì)胞術(shù)來確定參考范圍需要較大的成本消耗，使得我國對健康兒童不同年齡段以及不同性別的外周血淋巴細(xì)胞亞群的研究較少，只有少數(shù)的實驗室建立了參考值[6,15,17，19]，絕大多數(shù)實驗室都通過國外的有關(guān)文獻(xiàn)以及試劑說明書來確定其參考范圍，這些參考值可能并不適合我國不同省份兒童。另外，本研究檢測了174例新生兒血樣標(biāo)本分析淋巴細(xì)胞亞群，檢測數(shù)據(jù)可為新生兒淋巴細(xì)胞亞群百分比的評估提供參考。文獻(xiàn)[20]指出，淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果應(yīng)首先根據(jù)下述公式進(jìn)行評估：T細(xì)胞(%)+B細(xì)胞(%)+NK細(xì)胞(%)=100%；CD4+T細(xì)胞(%)+CD8+T細(xì)胞(%)=T細(xì)胞(%)。本研究所得出參考值的中位數(shù)符合上述公式，證實了研究結(jié)果符合各淋巴細(xì)胞亞群保持一定比例的規(guī)律。

本研究的不足：確定醫(yī)學(xué)參考值范圍的樣本量如果性別間可能有差別，不同性別的樣本量應(yīng)至少達(dá)到100例，本文女生組中樣本量不足。