藍(lán)莓根腐病生防細(xì)菌的篩選與鑒定

葉嬋，周南，蔣選利

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025； 2. 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

由真菌引起的藍(lán)莓病害已達(dá)20 種以上[1-2]。藍(lán)莓根腐病(Fusariumoxysporum)是一種真菌性維管束土傳病害，植株只要發(fā)病即可導(dǎo)致整株死亡，是藍(lán)莓生產(chǎn)上的主要病害；該病害在貴州省黔東南黃平、麻江、丹寨等縣以及黔西南、黔南部分藍(lán)莓種植地區(qū)廣泛發(fā)生[2]。該病害的防治措施目前以化學(xué)防治為主，但長期使用農(nóng)藥會(huì)帶來生態(tài)環(huán)境安全問題；利用微生物及其代謝產(chǎn)物防治植物病害已成為植物病害生物防治技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)[3]。

篩選生防菌是生物防治的基礎(chǔ)，也是生物防治成功與否的關(guān)鍵。張寶 等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens對(duì)尖孢鐮刀菌有很強(qiáng)的抑制作用[4]，該菌株對(duì)棉花枯萎病有較好的田間防治效果[5]，該菌發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌也有較強(qiáng)的抑制作用，能形成明顯的抑菌圈[6]。曹云 等研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis對(duì)尖孢鐮刀菌有良好的拮抗效果[7]，對(duì)尖孢鐮刀菌引起的根腐病防效高達(dá)73.60%[8]，其發(fā)酵液對(duì)尖孢鐮刀菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)也有很好的抑制作用[9]。劉蓮娜 等研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis對(duì)尖孢鐮刀菌有較強(qiáng)的抑菌活性[10]，其胞外分泌蛋白對(duì)尖孢鐮刀菌也有一定的抑制效果[11]，該菌還能抑制尖孢鐮刀菌黃瓜?；途z的生長和分生孢子的萌發(fā)，而且其發(fā)酵液也具有很強(qiáng)的抑制作用[12]。

為了促進(jìn)有機(jī)藍(lán)莓的生產(chǎn)，保障藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，作者進(jìn)行藍(lán)莓根腐病生防菌的篩選與鑒定試驗(yàn)，探尋控制藍(lán)莓根腐病的生防細(xì)菌，以期為研發(fā)藍(lán)莓根腐病生防制劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 土壤樣品的采集 2015—2016年在貴州省麻江縣和丹寨縣藍(lán)莓果園，先后5次從藍(lán)莓植株根圍采集土壤土樣60份。撥開表層土約10 cm，采集藍(lán)莓植株根圍土約50 g，裝袋并帶回試驗(yàn)室。

1.2 細(xì)菌的分離純化 采用土壤稀釋法分離土樣中的細(xì)菌，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待平板上長出明顯單菌落，用NA培養(yǎng)基純化單菌落并斜面保存分離的菌株，供篩選。

1.3 拮抗菌株的篩選 采用平板對(duì)峙法測(cè)定各分離菌株對(duì)藍(lán)莓根腐病菌尖孢鐮刀菌(貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供)的抑菌活性，以只在平板中心處接種病原菌為對(duì)照(CK)。初篩設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)拮抗效果較好的菌株進(jìn)行復(fù)篩，復(fù)篩設(shè)置5個(gè)重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)5 d。測(cè)量相對(duì)拮抗細(xì)菌方向病原菌生長的直徑(D)和抑菌帶寬度(d)，計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-0.5 cm)×100

1.4 盆栽接種抑菌測(cè)定 選擇抑制率較高的B6、B7和B10菌株，在大棚條件下進(jìn)行盆栽接種抑菌測(cè)定。選用長勢(shì)一致的藍(lán)莓幼苗兔眼6號(hào)(由貴州省麻江縣果品工程中心提供)，連帶育苗基質(zhì)移栽至直徑30 cm的營養(yǎng)缽，加黃壤營養(yǎng)土，經(jīng)高溫滅菌、自然放涼后每盆移栽1株幼苗。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)生防菌處理和1個(gè)對(duì)照處理，每個(gè)處理均盆栽15盆藍(lán)莓幼苗。拮抗菌B6、B7和B10細(xì)菌懸液處理濃度均為1×108CFU/mL，藍(lán)莓根腐病的病原菌尖孢鐮刀菌菌懸液接種濃度為1×106CFU/mL，接種后30 d調(diào)查發(fā)病情況，以發(fā)病率表示盆栽抑菌效果。處理1：分別用B6、B7和B10細(xì)菌懸浮液300 mL處理盆栽藍(lán)莓幼苗，48 h后接種100 mL尖孢鐮刀菌菌懸浮液；處理2：分別用B6、B7和B10細(xì)菌懸浮液300 mL處理盆栽藍(lán)莓幼苗，然后立即接種100 mL尖孢鐮刀菌菌懸浮液；處理3：先用100 mL尖孢鐮刀菌菌懸浮液接種藍(lán)莓幼苗，48 h后分別用B6、B7和B10細(xì)菌懸浮液300 mL處理；處理4：先用100 mL尖孢鐮刀菌菌懸浮液接種盆栽藍(lán)莓幼苗，96 h后分別用B6、B7和B10細(xì)菌懸浮液300 mL處理；對(duì)照：以100 mL尖孢鐮刀菌菌懸浮液接種盆栽藍(lán)莓幼苗、澆灌300 mL清水。計(jì)算發(fā)病率。

發(fā)病率(%)=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100

1.5 生防細(xì)菌的鑒定 采用形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)方法鑒定。即通過顯微鏡直接觀察菌落及菌體形態(tài)，以及革蘭氏染色反應(yīng)、芽孢染色后的觀察，初步鑒定生防細(xì)菌的種類。然后用Biomiga公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取生防細(xì)菌的DNA，參考韋鑫[13]的PCR程序設(shè)置和反應(yīng)體系，以細(xì)菌DNA為模板，用細(xì)菌通用引物27f(5′ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)和1492r(5′TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3′)進(jìn)行16S rDNA基因片段的擴(kuò)增。由昆明碩擎生物工程有限公司對(duì)未純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，將所得測(cè)序通過Blast與已知序列進(jìn)行同源性分析和序列比對(duì)。

1.6 數(shù)據(jù)分析 生防細(xì)菌抑菌率測(cè)定的數(shù)據(jù)和盆栽抑菌試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別采用SPSS 21.0軟件和Excel 2007進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株篩選結(jié)果 土壤中分離的538株細(xì)菌經(jīng)過初篩和復(fù)篩得到了10株對(duì)尖孢鐮刀菌抑菌活性較好的菌株，各處理菌落直徑顯著低于對(duì)照(CK)菌落直徑，B7處理的抑菌帶最寬(圖1)。10株生防細(xì)菌的抑制率及其差異顯著性見表1，其中B6，B7，B9的抑制率分別為83.89%，82.44%，79.39%;極顯著大于B2，B3，B4(P<0.01)；而與B8，B10均無顯著性差異。

表1 生防細(xì)菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑菌作用測(cè)定

注：同列不同大寫字母表示組間差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 生防細(xì)菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制作用

2.2 盆栽幼苗抑菌測(cè)定結(jié)果 生防細(xì)菌B6、B7和B10菌株在盆栽藍(lán)莓幼苗上對(duì)藍(lán)莓根腐病原菌尖孢鐮刀菌均有一定的抑菌效果。其中以B6菌株的抑菌效果最好，4種方式處理后藍(lán)莓幼苗發(fā)病率均低于B7和B10菌株，最低發(fā)病率僅為13.3%。4種不同時(shí)間處理間，抑菌效果明顯不同，以拮抗菌處理幼苗后立即接種病原菌(處理2)的抑菌效果最好(表2)。

表2 3株生防細(xì)菌不同方式處理后盆栽藍(lán)莓幼苗的發(fā)病率 %

2.3 生防細(xì)菌鑒定結(jié)果

2.3.1 形態(tài)特征和染色結(jié)果 10株生防細(xì)菌菌落均呈乳白、不透明、表面光滑或粗糙、邊緣整齊或不整齊的圓形或規(guī)則或不規(guī)則狀；顯微鏡油鏡下，菌體均呈具方端或圓端直桿狀，革蘭氏染色均為陽性，均呈紫色(圖2)，芽孢染色菌體均呈藍(lán)色，都能產(chǎn)橢圓形或圓形芽孢(圖3)。結(jié)果表明，所鑒定的10株生防細(xì)菌均為芽孢桿菌屬Bacillus細(xì)菌。

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 一般來說，同源相似性大于97%的兩株細(xì)菌就是同種[14]。通過Blast進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析后，發(fā)現(xiàn)10株拮抗細(xì)菌與已知菌株的同源相似性均大于99.5%，9株為已知菌種(表3)。

圖2 10株生防細(xì)菌革蘭氏染色結(jié)果

圖3 10株生防細(xì)菌芽孢染色結(jié)果

菌株相似菌株登錄號(hào) 相似性B1Bacillus sp.HQ31716799.9%B2B. amyloliquefacien解淀粉芽孢桿菌NR_041455.199.7%B3B. amyloliquefaciens subsp. 解淀粉芽孢桿菌亞種JF89925399.9%B4B. subtilis枯草芽孢桿菌EU48951799.8%B5B. siamensis暹羅芽孢桿菌KT781674.199.9%B6B. siamensis暹羅芽孢桿菌KY643639.199.9%B7B. velezensis貝萊斯芽孢桿菌KY694464.199.9%B8B. tequilensis特基拉芽孢桿菌NR_104919.199.6%B9B. subtilis subsp. 枯草芽孢桿菌亞種CP010052.199.8%B10B. amyloliquefaciens解淀粉芽孢桿菌FN597644.199.9%

3 結(jié)論與討論

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，鑒定9株生防細(xì)菌分別為解淀粉芽孢桿菌3株、枯草芽孢桿菌2株、暹羅芽孢桿菌2株、貝萊斯芽孢桿菌1株、特基拉芽孢桿菌1株。其中暹羅芽孢桿菌B6菌株對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制率高達(dá)83.89%，其次是貝萊斯芽孢桿菌B7菌株和枯草芽孢桿菌B9菌株。平板對(duì)峙中抑制率較好的株暹羅芽孢桿菌B6菌株、貝萊斯芽孢桿菌B7菌株、解淀粉芽孢桿菌B10菌株對(duì)尖孢鐮刀菌盆栽幼苗接種抑菌試驗(yàn)中，以B6菌株的抑菌效果相對(duì)最好，發(fā)病率僅為13.3%；拮抗菌不同時(shí)間處理的抑菌效果差異明顯不同，以拮抗菌處理幼苗后立即接種病原菌的抑菌效果相對(duì)最好，其次是拮抗菌處理幼苗48 h后接種病原菌與接種病原菌48 h后拮抗菌處理幼苗，其中以接種病原菌96 h后拮抗菌處理幼苗的抑菌效果相對(duì)最差。

目前，國內(nèi)外對(duì)尖孢鐮刀菌的生防細(xì)菌研究較多的是解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌和多粘芽孢桿菌Bacilluspolymyxa等。本試驗(yàn)篩選出的解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌對(duì)尖孢鐮刀菌的的拮抗效果與其相似，說明這些菌株類群在尖孢鐮刀菌生物防治方面具有較好效果和穩(wěn)定性。

國內(nèi)關(guān)于暹羅芽孢桿菌的報(bào)道較少，僅研究報(bào)道暹羅芽孢桿菌的發(fā)酵液及其發(fā)酵液粗產(chǎn)物對(duì)尖孢鐮刀菌有很好的抑菌活性[15]。本試驗(yàn)篩選出的暹羅芽孢桿菌的平板拮抗效果(83.89%)和盆栽抑菌效果均最好，藍(lán)莓幼苗發(fā)病率僅為13.3%，因此開發(fā)和利用暹羅芽孢桿菌用于尖孢鐮刀菌的生物防治方面前景廣闊。本文首次報(bào)道特基拉芽孢桿菌對(duì)尖孢鐮刀菌具有較好的拮抗作用，其抑制率高達(dá)77.12%，但平板檢測(cè)只是特基拉芽孢桿菌的室內(nèi)篩選結(jié)果，要確定其真正的生防作用，還需進(jìn)一步的田間試驗(yàn)。暹羅芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌是對(duì)土傳真菌性病害具有拮抗作用的細(xì)菌，且對(duì)尖孢鐮刀菌的拮抗效果顯著，但未見暹羅芽孢桿菌和特基拉芽孢桿菌用于防治植物病害，是否可以作為生防菌還需要進(jìn)一步的安全性評(píng)價(jià)。

由于僅見藍(lán)莓根腐病病原和藍(lán)莓根腐病發(fā)生情況調(diào)查的相關(guān)基礎(chǔ)研究的報(bào)道[2,16-17]，目前國內(nèi)外尚未建立藍(lán)莓根腐病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)從藍(lán)莓根圍土中篩選藍(lán)莓根腐病的生防菌，采用發(fā)病率來表示生防細(xì)菌對(duì)盆栽藍(lán)莓幼苗根腐病病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌效果，可能比較粗糙，為了更好表示藍(lán)莓根腐病的發(fā)病程度及其防治效果，建立科學(xué)的藍(lán)莓根腐病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)是非常必要的。