共培養(yǎng)微藻Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3提高油脂產(chǎn)率和沉降率

肖鈞木，趙飛燕，崔 娜，丁 巍，余旭亞，徐軍偉，趙 鵬

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500)

由于傳統(tǒng)化石燃料的日漸衰竭和環(huán)境問(wèn)題的日益緊張，對(duì)可再生環(huán)境友好型能源的探索需求也越來(lái)越迫切[1]。以微藻油脂為原料的第三代生物柴油是一種對(duì)環(huán)境無(wú)污染且可再生的新型生物能源，在技術(shù)上已經(jīng)可以進(jìn)行生產(chǎn)，但由于成本較高，尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化。微藻產(chǎn)油的關(guān)鍵在于提高油脂產(chǎn)率和降低采收成本，較低的油脂產(chǎn)率是微藻產(chǎn)油相對(duì)于傳統(tǒng)化石燃料的劣勢(shì)[2]，目前還未能得到很好的解決；而較高的采收成本制約著微藻生物柴油的工業(yè)化生產(chǎn)。據(jù)相關(guān)研究[3]表明，微藻生物柴油的采收成本占總生產(chǎn)成本的20%～30%。因此，提高油脂產(chǎn)率和降低采收成本，是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化微藻產(chǎn)油的當(dāng)務(wù)之急。

現(xiàn)有提高油脂產(chǎn)率的方法包括基因敲除[4]、添加誘導(dǎo)劑[5]、非生物脅迫、添加金屬離子[6]、發(fā)酵罐培養(yǎng)和跑道池培養(yǎng)等。采收方法有離心法、沉降法、過(guò)濾法和絮凝劑法等[7]。但是在微藻合成油脂和微藻采收方面，這些方法存在著能耗高、效率低、需增加額外的設(shè)備、前期投入較大、成本高等缺陷。

有研究[8]表明，共培養(yǎng)能使培養(yǎng)體系內(nèi)的兩種微藻間產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，促進(jìn)油脂的合成，進(jìn)而提高油脂含量和油脂產(chǎn)率，并且具有能耗低、效率高、成本低和污染小等優(yōu)點(diǎn)。微藻細(xì)胞較小，細(xì)胞表面帶負(fù)電荷，細(xì)胞間相互排斥，難以聚集形成絮凝沉淀，自然沉降收集微藻細(xì)胞較為困難[9]。通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)后體系的pH，能夠降低微藻細(xì)胞表面電勢(shì)，有效促進(jìn)細(xì)胞間的聚集，加速細(xì)胞的沉降，便于微藻細(xì)胞的采收[3,10]。本文對(duì)兩株單針藻Monoraphidiumsp. eh1和Monoraphidiumsp. eh3進(jìn)行共培養(yǎng)，對(duì)油脂產(chǎn)率及絮凝效率進(jìn)行研究，以期找尋一種同時(shí)兼顧提高油脂產(chǎn)率及促進(jìn)細(xì)胞絮凝沉降的方法，為微藻生物柴油的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可行的應(yīng)用思路和一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

單針藻Monoraphidiumsp. eh1(簡(jiǎn)稱eh1)和Monoraphidiumsp. eh3(簡(jiǎn)稱eh3)，均從云南省高原淡水湖洱海(N25°36′～25°58′，E100°06′～100°18′)水樣中分離得到，純化培養(yǎng)后經(jīng)18S rRNA比對(duì)并結(jié)合形態(tài)學(xué)分析鑒定為單針藻。BG-11培養(yǎng)基，調(diào)整pH至7.0后121℃高壓滅菌20 min備用。

TS-1102恒溫(恒濕)振蕩搖床，JS94H Zeta電位分析儀，5810R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó))，Agilent 7890氣相色譜儀，Specord Plus分光光度儀，VITLAB英霍夫沉降管(德國(guó))，LDZX-50KBS滅菌鍋，F(xiàn)A2004N分析天平，HHW-D6水浴鍋，磁力攪拌器。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微藻培養(yǎng)

在含有300 mL培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，接種單針藻e(cuò)h1與單針藻e(cuò)h3，初始細(xì)胞濃度均為2.00×106個(gè)/mL，在恒溫?fù)u床進(jìn)行共培養(yǎng)，控制培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度25℃、轉(zhuǎn)速150 r/min、光照強(qiáng)度3 500 lx。另外，分別接種eh1、eh3進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)，初始細(xì)胞濃度均為4.00×106個(gè)/mL。

1.2.2 生物量和比生長(zhǎng)速率測(cè)定

取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的藻液，于13 000g離心5 min，去上清，去離子水反復(fù)洗滌沉淀3次得濕藻體，冷凍干燥后稱重計(jì)算生物量及生物量產(chǎn)率。生物量=干藻質(zhì)量/藻液體積，生物量產(chǎn)率=生物量/培養(yǎng)時(shí)間。

使用血球計(jì)數(shù)板測(cè)量細(xì)胞濃度，取接種當(dāng)天和培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的細(xì)胞濃度計(jì)算比生長(zhǎng)速率[11]。

1.2.3 油脂提取

培養(yǎng)至穩(wěn)定期的藻液轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，于8 000g離心5 min，去掉上清，將濕藻體放入-80℃冰箱中冷凍過(guò)夜后，凍干機(jī)上樣冷凍干燥36 h，得到干藻粉。油脂提取采用Bligh & Dyer法[12]。稱取干藻粉0.2 g、石英砂0.4 g，于研缽中研磨至細(xì)胞充分破碎油脂釋放，將藻粉轉(zhuǎn)移至5 mL EP管，向研缽中加入3 mL氯仿-甲醇以混合殘留的藻粉，并轉(zhuǎn)移到已裝有干藻粉的EP管中，然后放置于搖床上，室溫、100 r/min振蕩提取20 min后，于2 000 r/min離心10 min收集溶劑相，剩余沉淀再用氯仿-甲醇重復(fù)提取2次，然后合并3次提取的溶劑相，40℃烘干48 h，冷卻至室溫后稱重，計(jì)算油脂含量和油脂產(chǎn)率。

油脂含量=W1/W0×100%

油脂產(chǎn)率=W0×C/(V×T)

式中：W1為提取的油脂質(zhì)量，mg；W0為藻粉干重，mg；C為油脂含量；V為藻液體積，L；T為培養(yǎng)時(shí)間，d。

1.2.4 脂肪酸組成分析及相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

將提取的油脂約100 mg加入2 mL 3%硫酸-甲醇充分混合，70℃水浴冷凝回流4 h，加入2 mL正己烷后置于搖床上，室溫、100 r/min振蕩萃取4 h，靜置后取上清用0.45 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，得到的脂肪酸甲酯(FAMEs)[13]進(jìn)行GC-MS分析[11]。計(jì)算得單一脂肪酸對(duì)應(yīng)十六烷值(CN)，根據(jù)脂肪酸組成再經(jīng)過(guò)組合模型估測(cè)生物柴油的十六烷值[14]。

1.2.5 硝酸鹽質(zhì)量濃度測(cè)定

采用比色法測(cè)定藻液中胞外硝酸鹽的質(zhì)量濃度。取1 mL微藻培養(yǎng)基混合液，在13 000g下離心5 min，取100 μL上清液，與400 μL 5%的水楊酸-H2SO4溶液混溶，于室溫反應(yīng)20 min，緩慢加入9.5 mL 2 mol/L NaOH溶液，靜置冷卻至室溫后，在410 nm處測(cè)量吸光度，計(jì)算硝酸鹽質(zhì)量濃度。

1.2.6 微藻沉降

單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)藻液分別培養(yǎng)至穩(wěn)定期，在自然條件和調(diào)節(jié)pH(利用1 mol/L HCl將培養(yǎng)后藻液pH調(diào)節(jié)至7.0)后進(jìn)行沉降率測(cè)定，并與單獨(dú)培養(yǎng)后添加絮凝劑的沉降率結(jié)果進(jìn)行比較。

將自然條件、調(diào)節(jié)pH、添加絮凝劑的藻液轉(zhuǎn)移至英霍夫沉降管(Imhoff Cones)[15]，沉降30 min，微藻液面下5 cm處取樣，于750 nm、1 cm光程進(jìn)行比色，計(jì)算沉降率(η)[16]。

η=(OD0-OD1)/OD0×100%

式中：OD0為開始沉降時(shí)藻液的光密度；OD1為沉降30 min時(shí)藻液的光密度。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)樣品設(shè)置3組平行，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Minitab軟件進(jìn)行分析。最小顯著性差異進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)研究不同實(shí)驗(yàn)的組間差異，且當(dāng)p<0.05具有顯著性意義，p<0.01具有極顯著性意義。

2.3 不同TSH水平與TG及LDL-C的相關(guān)性分析 為進(jìn)一步分析不同TSH水平與脂質(zhì)代謝之間的相關(guān)性，將女性亞臨床甲減人群以TSH 10 mIU/L為分界進(jìn)行分層，并對(duì)不同TSH水平與TG及LDL-C的相關(guān)性進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，TG水平與TSH水平顯著相關(guān)，尤其是TSH>10mIU/L時(shí)TG升高的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加(β=1.84、OR=4.96、95%CI為1.83～13.51、P=0.002)，4.2 mIU/L

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)特性

不同培養(yǎng)體系的微藻生長(zhǎng)曲線及硝酸鹽消耗情況見(jiàn)圖1。

由圖1A可以看出，所有微藻生長(zhǎng)均未出現(xiàn)明顯的停滯期，用于接種的種子液狀態(tài)良好，實(shí)驗(yàn)未出現(xiàn)雜菌污染現(xiàn)象。eh1單獨(dú)培養(yǎng)26 d細(xì)胞濃度達(dá)到27.9×106個(gè)/mL；eh3單獨(dú)培養(yǎng)26 d細(xì)胞濃度達(dá)到47.8×106個(gè)/mL；而eh1和eh3共培養(yǎng)20 d細(xì)胞濃度達(dá)到40.0×106個(gè)/mL。這是由于eh1和eh3共培養(yǎng)產(chǎn)生了環(huán)境內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，更快地消耗了培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在較短的時(shí)間進(jìn)入了穩(wěn)定期，縮短了生長(zhǎng)周期和培養(yǎng)時(shí)間。由圖1B可以看出，不同培養(yǎng)體系中的硝酸鹽幾乎都被耗盡，對(duì)比單獨(dú)培養(yǎng)體系和共培養(yǎng)體系，共培養(yǎng)體系在16 d時(shí)已經(jīng)消耗絕大部分硝酸鹽，此時(shí)eh1單獨(dú)培養(yǎng)體系中還剩余47%的硝酸鹽，eh3單獨(dú)培養(yǎng)體系中則為17%，這表示共培養(yǎng)體系更早地出現(xiàn)了氮缺陷現(xiàn)象從而進(jìn)入了氮限制狀態(tài)。這種情況的產(chǎn)生可能與共培養(yǎng)有關(guān)，共培養(yǎng)使得兩種微藻產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，誘導(dǎo)其各自產(chǎn)生了單獨(dú)培養(yǎng)下不會(huì)發(fā)生的代謝途徑，產(chǎn)生了不同于單獨(dú)培養(yǎng)下的代謝產(chǎn)物，在此過(guò)程中硝酸鹽消耗速率提升。因此，共培養(yǎng)是一種可以縮短微藻生長(zhǎng)周期及培養(yǎng)時(shí)間的培養(yǎng)方法。

2.2 油脂產(chǎn)率

微藻油脂生產(chǎn)能力是衡量微藻是否具備生物柴油生產(chǎn)能力的依據(jù)。一般油脂含量較高的微藻生物量較低，而生物量較高的微藻油脂含量較低[17]。本實(shí)驗(yàn)綜合考量以上兩個(gè)指標(biāo)，選取油脂產(chǎn)率作為評(píng)價(jià)微藻油脂生產(chǎn)能力的標(biāo)準(zhǔn)。eh1和eh3單獨(dú)培養(yǎng)26 d及共培養(yǎng)20 d的油脂產(chǎn)率見(jiàn)表1。

表1 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3

由表1可以看出，eh3單獨(dú)培養(yǎng)的生物量產(chǎn)率最低，共培養(yǎng)生物量產(chǎn)率最高，eh1單獨(dú)培養(yǎng)的油脂含量最低，共培養(yǎng)的油脂含量最高，eh3的油脂產(chǎn)率最低，共培養(yǎng)的油脂產(chǎn)率最高。由于共培養(yǎng)氮源消耗較快而進(jìn)入了氮限制狀態(tài)，已有的研究[18]表明，氮限制能增加脂肪酸?；鵆o-A的細(xì)胞內(nèi)含量并激活二?；视王；D(zhuǎn)移酶，將脂肪酸酰基Co-A轉(zhuǎn)化為甘油三酯，當(dāng)微藻處于低氮含量培養(yǎng)基中時(shí)，其油脂含量會(huì)高于較高氮含量培養(yǎng)基中的微藻[19]，同時(shí)共培養(yǎng)縮短了培養(yǎng)時(shí)間，最終使得其油脂產(chǎn)率相較于單獨(dú)培養(yǎng)有了很大的提升。

2.3 脂肪酸組成

本實(shí)驗(yàn)就各種培養(yǎng)體系獲得的油脂進(jìn)行了脂肪酸組成分析。另外，由于在沉降實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)藻液pH進(jìn)行了調(diào)節(jié)，為了明確pH是否會(huì)對(duì)油脂質(zhì)量產(chǎn)生影響，將共培養(yǎng)的藻液調(diào)節(jié)pH(7.0)后進(jìn)行了油脂的提取，并進(jìn)行了脂肪酸組成分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3單獨(dú)培養(yǎng)及共培養(yǎng)微藻油脂脂肪酸組成及含量 %

2.4 微藻的沉降

沉降率是衡量微藻采收效率的標(biāo)準(zhǔn)之一，較高的沉降率表示在短時(shí)間內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)高效的采收。已有的提高微藻采收效率的方法中，添加絮凝劑是一種有效的手段。本實(shí)驗(yàn)對(duì)單獨(dú)培養(yǎng)26 d的eh1和eh3添加不同種類和劑量的絮凝劑，并測(cè)定沉降率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 Monoraphidium sp. eh1和Monoraphidium sp. eh3添加絮凝劑的沉降率

從表3可以看出，添加絮凝劑對(duì)eh1和eh3沉降率都有顯著的提升。在已有的研究[20-22]中，添加絮凝劑是促進(jìn)沉降的有效方法。在對(duì)小球藻(UTEX 265)的研究中[18]，添加400 mg/L FeCl3沉降率可達(dá)80%左右，低于本實(shí)驗(yàn)添加同等濃度FeCl3的eh3的沉降率92.85%，但添加600 mg/L FeCl3的沉降率最高為95%[18]，高于本實(shí)驗(yàn)添加同等濃度FeCl3的eh1的沉降率90.47%，而添加200 mg/L明礬的沉降率最高為20%[18]，本實(shí)驗(yàn)添加同等濃度明礬的eh1和eh3沉降率分別為90.46%和91.77%。在對(duì)螺旋藻(Spirulina)、小球藻(Chlorella)、顫藻(Oscillatoria)和藍(lán)藻(Synechocystis)的研究[19]中，添加15 mg/L殼聚糖的沉降率最高為92%，低于本實(shí)驗(yàn)添加同等濃度殼聚糖的eh1的沉降率96.86%，但高于未出現(xiàn)沉降效果的eh3。在對(duì)柵藻(Scenedesmusquadricauda)的研究[22]中，添加40 mg/L的聚丙烯酰胺(陽(yáng)離子)沉降率可達(dá)90%，低于本實(shí)驗(yàn)添加6 mg/L聚丙烯酰胺(陽(yáng)離子)的eh1(99.80%)和eh3(97.11%)沉降率。絮凝劑用量的差異可能來(lái)自于藻種的不同和測(cè)量計(jì)算方法的差異，實(shí)驗(yàn)添加絮凝劑效果與已有研究大致相同。

同時(shí)，共培養(yǎng)調(diào)節(jié)pH也是一種高效的采收方式。微藻在不同條件(自然條件、添加絮凝劑和調(diào)節(jié)pH)下，eh1和eh3單獨(dú)培養(yǎng)26 d及共培養(yǎng)20 d的沉降率見(jiàn)圖2。

注：添加絮凝劑均為最優(yōu)添加量下的沉降率。

由圖2可見(jiàn)，自然條件下eh1、eh3單獨(dú)培養(yǎng)和共培養(yǎng)30 min沉降率分別為10.01%、53.60%和50.78%。無(wú)論是單獨(dú)培養(yǎng)還是共培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中并未產(chǎn)生明顯的液面分層，結(jié)合沉降實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象和數(shù)據(jù)認(rèn)為自然條件下各組均不具有明顯的沉降效果。調(diào)節(jié)pH為7.0后進(jìn)行沉降實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示單獨(dú)培養(yǎng)的eh1、eh3沉降率分別為16.40%和56.70%，無(wú)顯著提升，而調(diào)節(jié)pH至7.0后的共培養(yǎng)體系沉降率可達(dá)到95.38%，較調(diào)節(jié)前的50.78%有顯著提升，且與添加某些絮凝劑的沉降率持平，具有顯著的沉降效果。

微藻在液體培養(yǎng)基中大多處于懸浮狀態(tài)，并因其表面所帶負(fù)電荷使得微藻細(xì)胞之間產(chǎn)生斥力，形成穩(wěn)定的懸濁液，導(dǎo)致采收困難[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是單獨(dú)培養(yǎng)，還是共培養(yǎng)均不能得到較好的沉降效果；添加絮凝劑后，無(wú)機(jī)絮凝劑(氯化鐵和明礬)所帶的陽(yáng)離子Fe3+和Al3+等與微藻表面的負(fù)電荷中和，消除了表面斥力實(shí)現(xiàn)了去膠粒化，有機(jī)絮凝劑則發(fā)揮網(wǎng)捕和架橋作用，將藻體通過(guò)包裹或連結(jié)的方式聚集到一起結(jié)成塊狀，這都促進(jìn)了微藻的絮凝沉降[22]；共培養(yǎng)后調(diào)節(jié)pH可以達(dá)到與添加絮凝劑相似的微藻細(xì)胞沉降效果，共培養(yǎng)使得不同微藻產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物在藻體外形成胞外聚合物[23]，這些胞外聚合物通過(guò)網(wǎng)捕架橋作用將藻體聚集在一起實(shí)現(xiàn)絮凝，這在一定程度上增強(qiáng)了絮凝效果，而調(diào)節(jié)pH后消除了微藻表面所帶電荷，使得藻體之間的斥力瓦解，進(jìn)一步促進(jìn)了藻體間的胞外聚合物將藻體絮凝成團(tuán)，實(shí)現(xiàn)短時(shí)間內(nèi)的快速沉降。

添加絮凝劑能夠?qū)崿F(xiàn)較好的采收，無(wú)機(jī)絮凝劑雖然價(jià)格較為低廉，但會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生較大污染，需要進(jìn)行嚴(yán)格的處理后才能排放，無(wú)形中增加微藻的采收成本；有機(jī)絮凝劑(聚丙烯酰胺(陽(yáng)離子)和殼聚糖等)污染較小，但因其價(jià)格較高，一般多用于高附加值產(chǎn)品，所以添加絮凝劑的方法不適用于大規(guī)模微藻的采收。而共培養(yǎng)后調(diào)節(jié)pH的方法，對(duì)沉降率提升顯著，與添加絮凝劑的沉降率接近，并且由于將藻液調(diào)節(jié)pH至中性，對(duì)環(huán)境造成的污染和破壞小，可以較大程度地降低采收后液體的后處理成本。

3 結(jié) 論

在油脂生產(chǎn)方面，共培養(yǎng)條件下的油脂產(chǎn)率較eh1、eh3單獨(dú)培養(yǎng)分別提高了1.22倍和1.53倍，增加較顯著；在采收方面，共培養(yǎng)后調(diào)節(jié)pH至7.0，30 min內(nèi)沉降率達(dá)到95.38%，遠(yuǎn)超過(guò)單獨(dú)培養(yǎng)條件下的沉降率，與添加絮凝劑的沉降率接近。微藻共培養(yǎng)結(jié)合調(diào)節(jié)pH為中性，是一種能有效提高油脂產(chǎn)率并降低采收成本的方法，具有較強(qiáng)實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。