濕法超微粉碎結(jié)合水酶法提取辣木籽油及其氧化穩(wěn)定性分析

王標(biāo)詩(shī)，胡小軍,張衛(wèi)國(guó),江 敏,彭元懷,張世奇,楊勝遠(yuǎn)

(1.嶺南師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，廣東 湛江 524048； 2.廣東省辣木資源開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524048)

辣木(Moringaoleifera)，又稱鼓槌樹，被稱為窮人的牛奶樹，日本譽(yù)其為不可思議之樹[1-2]。2012年，國(guó)家衛(wèi)生部第19號(hào)公告批準(zhǔn)辣木葉為新資源食品，為辣木產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)和市場(chǎng)化推廣開辟了新途徑。辣木渾身是寶，除辣木葉外，辣木籽也有很高的開發(fā)利用價(jià)值。

辣木籽中含有豐富的油脂，在國(guó)外辣木籽油被作為可持續(xù)的生物能源。國(guó)內(nèi)外對(duì)辣木籽油的提取已有相關(guān)報(bào)道，如Bhutada等[3]報(bào)道了有機(jī)溶劑提取辣木籽油，也有借助超聲波技術(shù)輔助有機(jī)溶劑提取辣木籽油[4]，但是有機(jī)溶劑用量大，污染環(huán)境。Zhao等[5]報(bào)道了超臨界CO2萃取技術(shù)提取辣木籽油工藝，但是成本較高。Nguyen等[6]首先應(yīng)用乙醇對(duì)辣木籽進(jìn)行預(yù)處理，再進(jìn)行超臨界CO2提取，出油率可適度提高。水酶法是一種環(huán)境友好的油脂提取新工藝[7-8]，馬李一[9]、劉華勇[10]和Yusoff[11]等報(bào)道了水酶法提取辣木籽油的工藝，但提取率都不太高。超微粉碎技術(shù)是近20年迅速發(fā)展起來(lái)的高新技術(shù)，能把原材料制成微米甚至納米級(jí)的微粉，已經(jīng)在各行業(yè)得到了應(yīng)用，如陳體強(qiáng)等[12]利用超微粉碎結(jié)合超臨界CO2技術(shù)分離靈芝孢子揮發(fā)油。

本文研究濕法超微粉碎結(jié)合水酶法提取辣木籽油工藝條件，并探討辣木籽油的氧化穩(wěn)定性。為辣木的深加工和副產(chǎn)物高值化綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

辣木籽，購(gòu)于湛江市旭異南藥種植專業(yè)合作社。

胰蛋白酶(5萬(wàn) U/g)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶(6萬(wàn) U/g)、酸性蛋白酶(5萬(wàn) U/g)、堿性蛋白酶(20萬(wàn) U/g)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；風(fēng)味蛋白酶(5萬(wàn) U/g)、復(fù)合蛋白酶(5萬(wàn) U/g)，江蘇瑞陽(yáng)生物科技有限公司；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為食品級(jí)抗氧化劑，其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3C型pH機(jī)，DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，DZF-6050 型真空干燥箱，F(xiàn)A2104N型電子精密分析天平，SXT-06索氏提取器，80-2電動(dòng)離心機(jī)，HZS-HA水浴振蕩器，F(xiàn)M-CF型濕法超微粉碎機(jī)，JYL-350A料理機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辣木籽的濕法超微粉碎預(yù)處理

辣木籽經(jīng)去殼后壓碎成小顆粒，用50%乙醇浸泡12 h后進(jìn)行濕法超微粉碎處理(功率3 kW)，再于低溫(40℃)真空干燥箱中烘48 h。瓶裝后置于干燥器中，備用。

同時(shí)將去殼后的辣木籽經(jīng)普通的料理機(jī)微粉碎后直接低溫干燥48 h，過40目篩備用，做對(duì)照樣品。

1.2.2 辣木籽含油率的測(cè)定

參考GB/T 5009.6—2003，以無(wú)水乙醚為抽提劑，用索氏抽提法測(cè)定辣木籽含油率。

辣木籽含油率=辣木籽油質(zhì)量/辣木籽質(zhì)量×100%

1.2.3 辣木籽油水酶法提取工藝

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后的辣木籽粉3 g于200 mL錐形瓶中，按比例加入一定量的水，混勻后于90℃水浴中滅酶10 min，冷卻至室溫后調(diào)pH(用磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié))，加酶，置于120 r/min恒溫振蕩器中，在設(shè)定的酶解溫度及酶解時(shí)間下進(jìn)行酶解，酶解完成后置于90℃水浴鍋中滅酶10 min，冷卻至室溫后以4 500 r/min離心30 min，收集上層油相，殘?jiān)?05℃烘箱內(nèi)烘12 h，測(cè)定殘?jiān)土坎⒂?jì)算辣木籽油提取率。

提取率=(原料中油質(zhì)量-殘?jiān)杏唾|(zhì)量)/原料中油質(zhì)量×100%

1.2.4 辣木籽油酸價(jià)、過氧化值的測(cè)定

酸價(jià)的測(cè)定，采用GB/T 5530—2005《動(dòng)植物油脂 酸值和酸度測(cè)定》；過氧化值的測(cè)定，采用GB/T 5538—2005《動(dòng)植物油脂 過氧化值測(cè)定》。

1.2.5 辣木籽油氧化穩(wěn)定性分析

參考葉麗紅等[13]實(shí)驗(yàn)方法。分別取15 g辣木籽油置于50 mL廣口瓶中，分別在2℃、室溫、60℃、室溫自然光、室溫避光條件下存放，24 h攪拌1次，取樣測(cè)定辣木籽油的過氧化值，研究溫度和光照對(duì)辣木籽油氧化穩(wěn)定性的影響；采用 Schaal 烘箱加速法，選擇BHT作為抗氧化劑，按0.01%的比例添加到辣木籽油中，混合均勻，密封置于恒溫箱中，在(60±1)℃條件下加速氧化，同時(shí)以不添加BHT的辣木籽油為對(duì)照，24 h攪拌1次，通過定時(shí)取樣測(cè)定辣木籽油的過氧化值來(lái)確定其抗氧化效果。

以上實(shí)驗(yàn)均平行3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣木籽的含油率

以無(wú)水乙醚為有機(jī)抽提溶劑，通過索氏提取器抽提得到辣木籽油，經(jīng)過計(jì)算可得辣木籽含油率為36.84%±0.45%。段瓊芬等[4]研究表明, 辣木籽含油率的平均值為37.24%，與本實(shí)驗(yàn)較為接近。劉華勇[10]研究表明，辣木籽中粗脂肪含量為38.03%，也與本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果比較接近。樊建麟等[14]研究表明，辣木籽中粗脂肪含量為40.12%，比本實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果稍高，可能是原料的來(lái)源不同等原因所致。

2.2 酶種類的選擇

分別在每種酶的最適pH、最適溫度下,酶添加量2.0%,料液比1∶5，按照1.2.3的方法酶解6 h, 考察胰蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、酸性蛋白酶+復(fù)合蛋白酶(比例1∶1，復(fù)合酶1)及中性蛋白酶+復(fù)合蛋白酶(1∶1，復(fù)合酶2)對(duì)辣木籽油提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 酶種類對(duì)辣木籽油提取率的影響

由圖1可知，在其他條件相同及各種酶的最適條件下，提取率最高的是中性蛋白酶+復(fù)合蛋白酶(1∶1)，提取率達(dá)72.13%，其次是中性蛋白酶，說(shuō)明中性蛋白酶與復(fù)合蛋白酶復(fù)配能使辣木籽內(nèi)的蛋白質(zhì)很好地分解，釋放出游離油。而提取率最低的為胰蛋白酶，僅為40.82%。因此，確定水酶法提取辣木籽油的最適酶為中性蛋白酶+復(fù)合蛋白酶(1∶1)。

2.3 粉碎方式對(duì)水酶法提取辣木籽油的影響

為了探討濕法超微粉碎對(duì)水酶法提取辣木籽油的影響，以普通的微粉碎處理作對(duì)比分析，在復(fù)合酶添加量2.0%、酶解溫度 55℃、料液比 1∶5、pH 5下酶解6 h, 考察粉碎方式對(duì)水酶法提取辣木籽油的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 粉碎方式對(duì)水酶法提取辣木籽油的影響

由圖2可知，濕法超微粉碎的樣品經(jīng)水酶法提取后，辣木籽油提取率達(dá)到72.13%，而微粉碎的樣品經(jīng)水酶法提取后，辣木籽油提取率僅60.35%，可見濕法超微粉碎能明顯提高辣木籽油的提取率，可使提取率增加11.78個(gè)百分點(diǎn)。

2.4 辣木籽油水酶法提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 復(fù)合酶添加量對(duì)辣木籽油提取率的影響

在料液比1∶9、pH 6.0、酶解溫度45℃下酶解6 h，探討中性蛋白酶+復(fù)合蛋白酶(1∶1)添加量對(duì)辣木籽油提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 復(fù)合酶添加量對(duì)辣木籽油提取率的影響

由圖3可知，在2%～5%范圍內(nèi)，隨著復(fù)合酶添加量的增大，辣木籽油提取率逐漸增加且上升趨勢(shì)明顯，當(dāng)復(fù)合酶添加量達(dá)到5%時(shí)，辣木籽油提取率達(dá)到72.40%，繼續(xù)增加復(fù)合酶添加量至6%時(shí)，辣木籽油提取率增加不明顯，之后再增加復(fù)合酶添加量，辣木籽油提取率開始降低且降幅相對(duì)較為明顯。考慮到經(jīng)濟(jì)成本等諸多方面的影響因素，確定最佳復(fù)合酶添加量為5.0%。

2.4.2 pH對(duì)辣木籽油提取率的影響

在料液比1∶9、復(fù)合酶添加量5.0%、酶解溫度45℃下酶解6 h，探討不同pH對(duì)辣木籽油提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對(duì)辣木籽油提取率的影響

由圖4可知，當(dāng)pH達(dá)到5.0時(shí)，辣木籽油提取率最高，達(dá)到74.30%，當(dāng)pH高于5.0或者小于5.0時(shí)，辣木籽油的提取率都相應(yīng)降低。因此，水酶法提取辣木籽油的最適pH應(yīng)控制在5.0左右。

2.4.3 料液比對(duì)辣木籽油提取率的影響

在復(fù)合酶添加量5.0%、pH 6.0、酶解溫度45℃下酶解6 h，探討不同料液比對(duì)辣木籽油提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

圖5 料液比對(duì)辣木籽油提取率的影響

由圖5可知，料液比從1∶5到1∶7，辣木籽油提取率逐漸上升，料液比1∶7時(shí)辣木籽油提取率最大，達(dá)到76.61%。之后隨料液比增大，辣木籽油提取率呈下降趨勢(shì)。可能由于料液比過低時(shí)，反應(yīng)體系流動(dòng)性差，不利于蛋白酶的作用，油脂不能很好溶出，因而油脂提取率較低；當(dāng)?shù)孜餄舛群兔笣舛冗_(dá)到合適的比例時(shí)，反應(yīng)速率加快，油脂提取率也隨之增加，但料液比過大時(shí)，底物濃度和酶濃度均被稀釋，影響酶與底物的反應(yīng)速率從而使提取率降低。因此，水酶法提取辣木籽油的最佳料液比為1∶7。

2.4.4 酶解時(shí)間對(duì)辣木籽油提取率的影響

在料液比1∶9、復(fù)合酶添加量5.0%、pH 6.0、酶解溫度45℃下進(jìn)行酶解，探討不同酶解時(shí)間對(duì)辣木籽油提取率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 酶解時(shí)間對(duì)辣木籽油提取率的影響

由圖6可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，辣木籽油提取率呈上升趨勢(shì)，當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到8 h以上時(shí)，辣木籽油提取率趨于平穩(wěn)?？赡苡捎诿附鈺r(shí)間越長(zhǎng)，油料細(xì)胞被蛋白酶降解越充分，酶作用越完全。因此，從節(jié)約能源和材料的角度考慮，水酶法提取辣木籽油的最佳酶解時(shí)間為8 h左右。

2.4.5 酶解溫度對(duì)辣木籽油提取率的影響

在料液比1∶9、復(fù)合酶添加量5.0%、pH 6.0下酶解6 h，探討不同酶解溫度對(duì)辣木籽油提取率的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解溫度對(duì)辣木籽油提取率的影響

由圖7可知，隨著酶解溫度的升高，辣木籽油提取率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)酶解溫度達(dá)到55℃，辣木籽油提取率最高，達(dá)到74.96%。過低或過高的溫度都會(huì)影響酶的活性，甚至可能導(dǎo)致酶蛋白變性，進(jìn)而影響酶與底物的作用，從而降低提取率。因此，水酶法提取辣木籽油的最佳酶解溫度為55℃。

2.5 辣木籽油水酶法提取正交實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，選擇中性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶按1∶1組成的復(fù)合酶為酶解用酶，pH為5.0，以辣木籽油提取率為考察指標(biāo)，復(fù)合酶添加量(A)、料液比(B)、 酶解時(shí)間(C)、酶解溫度(D)為考察因素，進(jìn)行 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化提取辣木籽油的最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表1可知，各因素對(duì)辣木籽油提取率的影響大小依次為復(fù)合酶添加量(A)>料液比(B)>酶解時(shí)間(C)>酶解溫度(D)。由極差分析中直觀得出最佳組合為A3B1C2D2,即復(fù)合酶添加量為6%，料液比為1∶6，酶解時(shí)間為8 h，酶解溫度為50℃。在該條件下做3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到辣木籽油提取率為85.23%±0.72%。馬李一等[9]研究結(jié)果表明，水酶法提取辣木籽油最高得油率為28.6%，如果換算成提取率不超過70%，故本實(shí)驗(yàn)最佳條件下的提取率要遠(yuǎn)高于其實(shí)驗(yàn)結(jié)果；而劉華勇[10]研究表明，水酶法提取辣木籽油最高提取率為76%，低于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其預(yù)處理方法與本實(shí)驗(yàn)明顯不同。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提取率較高的主要原因可能是對(duì)原料進(jìn)行了超微粉碎預(yù)處理，對(duì)辣木籽細(xì)胞壁的破壞力更強(qiáng)，并在處理過程中使用復(fù)合蛋白酶對(duì)辣木籽進(jìn)行處理，使油脂更容易與蛋白質(zhì)等成分分離，故提取效果更好。

2.6 辣木籽油的酸價(jià)和過氧化值

利用上述最佳工藝條件提取辣木籽油,用國(guó)標(biāo)法測(cè)出其酸價(jià)(KOH)為0.012 mg/g，過氧化值為1.03 meq/kg。與馬李一等[9]報(bào)道的辣木籽油酸價(jià)較為接近，而本實(shí)驗(yàn)得到的過氧化值更低。

2.7 辣木籽油的氧化穩(wěn)定性

2.7.1 溫度對(duì)辣木籽油氧化穩(wěn)定性的影響 (見圖8)

由圖8可知，在各溫度下放置10 d，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，辣木籽油的過氧化值均呈上升趨勢(shì)，且溫度越高，過氧化值增加越明顯，說(shuō)明辣木籽油的自動(dòng)氧化一直在不斷進(jìn)行，且溫度越高，辣木籽油的氧化程度越高。因此，低溫有利于辣木籽油的保存，能夠延緩辣木籽油的自動(dòng)氧化。

圖8 溫度對(duì)辣木籽油氧化穩(wěn)定性的影響

2.7.2 光照對(duì)辣木籽油氧化穩(wěn)定性的影響(見圖9)

圖9 光照對(duì)辣木籽油氧化穩(wěn)定性的影響

由圖9可知，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，辣木籽油的過氧化值一直在不斷增加，在室溫避光條件下辣木籽油的過氧化值變化幅度較小，而放置在室溫自然光條件下的辣木籽油過氧化值隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)變化較為劇烈，放置10 d，辣木籽油過氧化值達(dá)到36.37 meq/kg，這是因?yàn)楣饽艽龠M(jìn)過氧化物的分解，還能引發(fā)游離基，促進(jìn)氧化反應(yīng)的進(jìn)行?？梢?，在較長(zhǎng)時(shí)間的保存過程中，光照對(duì)辣木籽油的影響較大。這與段瓊芬等[15]的研究結(jié)果基本一致。

2.7.3 抗氧化劑對(duì)辣木籽油氧化穩(wěn)定性的影響(見圖10)

圖10 抗氧化劑對(duì)辣木籽油氧化穩(wěn)定性的影響

由圖10可知，在辣木籽油中添加一定量抗氧化劑BHT的情況下，于60℃烘箱中進(jìn)行加速氧化反應(yīng)，隨著辣木籽油保存時(shí)間的延長(zhǎng)，其過氧化值逐漸增加，在相同時(shí)間內(nèi)，不添加抗氧化劑的辣木籽油過氧化值更高，說(shuō)明添加抗氧化劑BHT能抑制辣木籽油的氧化。因此，在辣木籽油的貯藏過程中，可以通過添加抗氧化劑的方法延長(zhǎng)辣木籽油的保質(zhì)期。這與葉麗紅等[13]研究的番木瓜籽油氧化穩(wěn)定性結(jié)果基本一致。

3 結(jié) 論

(1)采用濕法超微粉碎預(yù)處理后再經(jīng)水酶法提取辣木籽油，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的最佳工藝條件為：以中性蛋白酶+復(fù)合蛋白酶(1∶1)為酶解用酶，酶添加量6%，料液比1∶6，酶解時(shí)間8 h，pH 5.0，酶解溫度50℃。在最佳工藝條件下，辣木籽油提取率為85.23%±0.72%。各因素對(duì)辣木籽油提取率的影響大小依次為復(fù)合酶添加量>料液比>酶解時(shí)間>酶解溫度。

(2)溫度、光照、氧氣均會(huì)引起貯藏過程中辣木籽油過氧化值的升高。其中光照比溫度對(duì)辣木籽油過氧化值的影響更大。因此，貯藏辣木籽油時(shí)，應(yīng)盡量放置低溫、陰涼、避光處。添加抗氧化劑可明顯抑制辣木籽油氧化，有效延長(zhǎng)辣木籽油的保質(zhì)期。