催產(chǎn)素受體在腸易激綜合征患者中的表達(dá)研究*

陳俊杰，楊長(zhǎng)青，張曉俊，柯少雄，盛淑婷，宋亮，王春蘭，魏子白

（1.長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院 消化內(nèi)科，山西 長(zhǎng)治 046000；2.長(zhǎng)治衛(wèi)生學(xué)校附屬醫(yī)院病理科，山西 長(zhǎng)治 046099）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome,IBS），是常見(jiàn)的功能性腸道疾病，IBS患者占消化科門(mén)診的30%～50%。該病癥狀為腹痛、腹部不適伴排便或排便習(xí)慣改變等，腹痛是IBS患者最突出的癥狀，影響患者的生活質(zhì)量和工作效率。多數(shù)研究認(rèn)為內(nèi)臟高敏感在IBS的發(fā)病中起重要作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)，催產(chǎn)素（Oxytocin,OT）/催產(chǎn)素受體（oxytocin receptor,OTR）信號(hào)在內(nèi)臟高敏感中起重要作用[1-2]，但其機(jī)制未明確。本實(shí)驗(yàn)對(duì)IBS患者腸道黏膜OTR的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以探討OTR與IBS的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年7～11月長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院附屬和平醫(yī)院消化內(nèi)科門(mén)診IBS患者27例為實(shí)驗(yàn)組，另選取同期體檢健康者14例作為對(duì)照組。IBS患者符合羅馬Ⅳ診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～65歲；②血尿便常規(guī)檢查無(wú)明顯異常；③腹部超聲、結(jié)腸鏡檢查無(wú)異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他疾??；②腹部手術(shù)史；③近1個(gè)月內(nèi)連續(xù)使用抗生素超過(guò)3 d；④近2周內(nèi)連續(xù)服用益生菌、通便藥、止瀉藥、促動(dòng)力藥超過(guò)3 d；⑤月經(jīng)期、妊娠或哺乳期婦女。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：①有IBS腹部手術(shù)史；②近1個(gè)月內(nèi)曾連續(xù)使用抗生素超過(guò)3 d；③近2周內(nèi)連續(xù)服用益生菌、通便藥、止瀉藥、促動(dòng)力藥超過(guò)3 d；④月經(jīng)期、妊娠或哺乳期婦女。對(duì)照組性別、年齡、生活環(huán)境等基本情況均與實(shí)驗(yàn)組相匹配。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象在參加本實(shí)驗(yàn)之前均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本的收集

結(jié)腸鏡下活檢距肛門(mén)口20～25 cm處鉗取結(jié)腸組織1塊，置于90%乙醇固定，石蠟包埋，保存。

1.3 IBS分型、癥狀嚴(yán)重度、伴隨心理異常評(píng)估

根據(jù)IBS患者糞便性狀將實(shí)驗(yàn)組分為IBS腹瀉型（irritable bowel syndrome with diarrhea）組（IBS-D 組）、IBS 不 定 型（irritable bowel syndrome unclassified） 組（IBS-U組）。所有IBS患者填寫(xiě)IBS病情嚴(yán)重程度調(diào)查表（IBS-SSS表）和醫(yī)院焦慮/抑郁情緒測(cè)定表（HAD量表），HAD量表得分＞8分為伴隨心理異常。

1.4 免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)染色：①脫蠟、水化；②PBS洗3次各5 min；③用蒸餾水配制新鮮的3%過(guò)氧化氫H2O2，37℃封閉 10 min，用蒸餾水洗 3 次各 5 min ；④高壓法抗原修復(fù)；⑤PBS洗3次各5 min；⑥滴加正常胎牛清封閉液，37℃封閉20 min，甩去多余液體；⑦滴加稀釋Ⅰ抗（艾博抗AB87312 1∶250）50 μl，4℃過(guò)夜；⑧37℃復(fù)溫30 min，PBS洗3次各5 min；⑨滴加生物素化Ⅱ抗（1∶250），37℃孵育20 min；⑩PBS洗3次各5 min。DAB顯色：①滴加顯色液，室溫顯色，反應(yīng)至顯微鏡下可見(jiàn)棕褐色顆粒為止，蒸餾水終止反應(yīng)；②蘇木精-伊紅復(fù)染8 min，流水沖洗；③脫水、透明、封片、鏡檢。光學(xué)顯微鏡下，OTR在細(xì)胞質(zhì)中呈棕黃色顆粒狀染色，無(wú)背景著色。細(xì)胞著棕黃色顆?；蚓€網(wǎng)狀為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片選取視野清晰的5個(gè)不重復(fù)的高倍物鏡視野（×400），運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)算光密度值并取均值進(jìn)行定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料以例表示，比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

實(shí)驗(yàn)組27例。其中，男性12例，女性15例；IBS-D組15例，IBS-U組12例；平均年齡（47±11）歲。對(duì)照組14例。其中，男性7例，女性7例；平均年齡（47±12）歲。IBS-D組、IBS-U組、對(duì)照組3組年齡與性別構(gòu)成比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=-0.239，P=0.813；χ2=0.114，P=0.754）。IBS-D 組與 IBS-U 組兩組年齡、性別、病情嚴(yán)重度調(diào)查表（IBS-SSS）評(píng)分、合并精神癥狀比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)情況

所有活檢結(jié)腸標(biāo)本中均可見(jiàn)OTR免疫反應(yīng)陽(yáng)性著色細(xì)胞（見(jiàn)圖1）。對(duì)照組結(jié)腸黏膜平均光密度值為（0.110±0.026），IBS-D結(jié)腸黏膜平均光密度值為（0.158±0.034），IBS-U組結(jié)腸黏膜平均光密度值為（0.163±0.035），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=10.996，P =0.000），IBS-U 組和 IBS-U 高于對(duì)照組（t=-4.201 和 -4.400，均P =0.000），IBS-D 組與IBS-U組兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.337，P=0.739）。見(jiàn)圖1、2。

表1 IBS-D組與IBS-U組基本情況比較

2.3 OTR表達(dá)與IBS-SSS、精神癥狀的相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)組結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)與IBS-SSS無(wú)相關(guān)性（r=0.160，P＞0.05）；與精神癥狀無(wú)相關(guān)性（r=-0.038，P＞0.05）。

圖1 OTR在各組結(jié)腸黏膜中的表達(dá) （×400）

圖2 各組OTR蛋白含量的比較 （±s）

3 討論

目前認(rèn)為IBS發(fā)病機(jī)制涉及內(nèi)臟高敏感、腸道菌群紊亂，腦-腸軸功能失調(diào)等多個(gè)環(huán)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)臟高敏感性是IBS的特征性病理生理機(jī)制[4]。

OT是由9個(gè)氨基酸構(gòu)成肽的類激素，在分娩和哺乳期作用眾所周知，在中樞和外周的廣泛作用如性、母性行為、社交、信任和炎癥調(diào)節(jié)已被公認(rèn)[5]。OTR的編碼屬于G蛋白耦聯(lián)受體家族，通過(guò)激活磷脂酶c發(fā)揮作用。OTR分布廣泛，除中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周OTR存在于乳腺、子宮肌層內(nèi)的子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜。OTR也被發(fā)現(xiàn)腎臟、心臟、脂肪細(xì)胞、胰腺和胸腺。此外，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，OTR在腸內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞、黏膜下神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和腸黏膜下層均有表達(dá)[6-7]。

目前發(fā)現(xiàn)OT/OTR信號(hào)在胃腸運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、腸道炎癥、腸黏膜通透性的維護(hù)方面均有生理意義[7-8]。研究顯示，外周注射OT可降低動(dòng)物模型的內(nèi)臟高敏感，應(yīng)用OT可減少應(yīng)激誘導(dǎo)的膀胱過(guò)敏[9]和三硝基苯磺酸（TNBS）誘導(dǎo)的結(jié)腸高敏感[10]。OT類似物對(duì)慢性腹痛小鼠具有鎮(zhèn)痛特性[11]?？傊?，OT可以調(diào)節(jié)人或動(dòng)物的內(nèi)臟高敏感。

ARAUJO等[11]研究表明，OTR在慢性內(nèi)臟痛大鼠模型背根神經(jīng)節(jié)表達(dá)明顯高于對(duì)照組大鼠，GONG等[10]發(fā)現(xiàn)在人和大鼠腸道黏膜的肥大細(xì)胞都有OTR表達(dá)，并且在內(nèi)臟高敏感中起重要作用。此外有研究表明，應(yīng)用阿托西班（OTR受體拮抗劑）可以增強(qiáng)對(duì)母嬰分離大鼠模型內(nèi)臟高敏感性恢復(fù)，且發(fā)現(xiàn)OTR在母嬰分離的大鼠結(jié)腸表達(dá)上調(diào)[11]。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OTR在IBS患者的結(jié)腸黏膜表達(dá)上調(diào)，證實(shí)OTR可能參與IBS內(nèi)臟高敏感的形成，與IBS存在聯(lián)系。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，OTR在結(jié)腸黏膜表達(dá)在IBS亞型之間無(wú)差異，OTR表達(dá)上調(diào)與IBS-SSS無(wú)相關(guān)。這可能是由于IBS發(fā)病機(jī)制的多元性，從而導(dǎo)致本研究結(jié)果中OTR的表達(dá)與IBS-SSS無(wú)相關(guān)。有研究表明僅中樞釋放的OT具有抗焦慮和抗應(yīng)激作用，外周OT并無(wú)此作用[12]，本研究發(fā)現(xiàn)IBS患者結(jié)腸黏膜OTR表達(dá)上調(diào)與IBS患者合并心理癥狀無(wú)關(guān)，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論。但目前許多研究發(fā)現(xiàn)外周OTR可以降低內(nèi)臟高敏感，GONG等[10]發(fā)現(xiàn)OT可作用于肥大細(xì)胞OTR抑制Ca2+-NOS通路、抑制肥大細(xì)胞的活化和脫顆粒、減輕內(nèi)臟高敏感。XU等[13]研究發(fā)現(xiàn)，外源性O(shè)T可作用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞OTR調(diào)節(jié)TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路抑制母嬰分離大鼠的內(nèi)臟高敏感。還有研究發(fā)現(xiàn)催產(chǎn)素通過(guò)作用于OTR激活腸神經(jīng)中氮能神經(jīng)元中的nNOS促進(jìn)NO釋放，NO擴(kuò)散到脊髓腸系膜神經(jīng)纖維打開(kāi)KATP通道，下調(diào)大鼠腸系膜傳入神經(jīng)的敏感性，從而降低內(nèi)臟高感[14]?？傊狙芯孔C實(shí)OTR與IBS有一定關(guān)聯(lián)，但OTR與IBS之間存在怎樣關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。