ICARDA小麥種質(zhì)抗條銹資源篩選和抗病基因分析

戴妙飛，穆京妹，王曉婷，王琪琳, 余世洲， 黃 碩，曾慶東，吳建輝，劉勝杰， 聶小軍，康振生，韓德俊

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 陜西楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥條銹病是由條形柄銹菌侵染引起的氣傳性葉部病害，在流行年份可使小麥減產(chǎn)25%，甚至導(dǎo)致絕收，威脅小麥的安全生產(chǎn)[1]。培育種植抗病品種是控制小麥條銹病最經(jīng)濟(jì)有效的措施。條銹菌小種變異會產(chǎn)生新致病性小種，進(jìn)而導(dǎo)致抗病性品種極易丟失抗性，這是造成小麥條銹病大流行的主要原因[2]。在2000-2012年間，CYR32、CYR33成為最流行的毒性小種[3]，其對很多小麥抗源具有毒力。繼CYR32、CYR33之后，CYR34成為新的流行性小種[4]。目前，CYR34已經(jīng)逐漸傳播到中國小麥主栽區(qū)，威脅到小麥安全生產(chǎn)[5]。中國小麥條銹菌的毒性多樣性使新抗源篩選顯得尤為緊迫和重要[6]。引進(jìn)并合理利用國外種質(zhì)資源是抗病育種的有效途徑[7]。從國外引進(jìn)抗病資源或轉(zhuǎn)育利用小麥近緣屬種的抗源，可豐富中國生產(chǎn)品種的抗病基因庫[8]。本課題組于2016年從總部設(shè)在敘利亞阿勒頗(Alepo)的國際干旱地區(qū)研究中心(International Centre for Agricultural Research in Dry Areas，ICARDA)獲得一批小麥材料。該地區(qū)的麥類種質(zhì)資源具有農(nóng)藝性狀優(yōu)良、抗病、抗熱、抗旱等特點(diǎn)，進(jìn)一步對其進(jìn)行抗病性鑒定和篩選可獲得抗病優(yōu)異種質(zhì)資源，以促進(jìn)中國小麥育種。本研究對203份ICARDA高代系材料進(jìn)行成株期和苗期抗條銹病鑒定和基因分析，以期從中篩選出對當(dāng)前中國流行小種表現(xiàn)穩(wěn)定持久抗性的材料，豐富抗源，促進(jìn)小麥抗條銹病育種。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的203份ICARDA小麥種質(zhì)材料由西北農(nóng)林科技大學(xué)宋衛(wèi)寧教授提供。已知抗條銹病基因的單基因系或載體材料由美國華盛頓州立大學(xué)陳賢明教授饋贈。感病對照品種Avocet S (AvS)由澳大利亞悉尼大學(xué)McIntosh教授提供。供試的條銹菌生理小種CYR32、CYR33和CYR34由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥銹病研究室經(jīng)單胞分離并由鑒別寄主鑒別后，對單胞菌系擴(kuò)繁獲得。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥條銹病鑒定

2016-2018年在陜西楊凌西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)站的條銹菌病圃，采用人工混合小種進(jìn)行小麥成株期抗病性鑒定。于三月中旬小麥拔節(jié)初期，誘發(fā)行采用礦物油噴霧法接種條銹菌混合小種CYR32/CYR33和CYR34。于4月下旬至5月中旬，銘賢169充分發(fā)病后，調(diào)查小麥成株期發(fā)病情況。按照0～9級標(biāo)準(zhǔn)記載反應(yīng)型和12級標(biāo)準(zhǔn)記載嚴(yán)重度[9-10]。將反應(yīng)型分為四個(gè)級別：0～3為抗病(resistance, R)，4～6為中抗(moderate resistance, MR)，7為中感病(moderate susceptible, MS)，8～9為感病(susceptible, S)[11]。另外，于2018年分別在甘肅天水(五月中旬至六月中旬)和四川江油(四月上旬至5月上旬)進(jìn)行成株期田間自然發(fā)病圃的抗病性鑒定，均于感病對照品種充分發(fā)病后進(jìn)行三次調(diào)查，鑒定標(biāo)準(zhǔn)同上。

苗期分小種鑒定于2018年10-12月在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病理研究所東南窯溫室進(jìn)行。將感病對照銘賢169和供試材料催芽后種植，麥苗長到二葉期時(shí)，按1∶50將條銹菌夏孢子與滑石粉均勻混合，用抖粉法分別接種條銹菌CRY32和CYR34。感病對照充分發(fā)病時(shí)進(jìn)行鑒定，每隔3 d重復(fù)調(diào)查一次,記載反應(yīng)型,共調(diào)查三次。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測

用改良CTAB法[12]提取DNA，選擇已經(jīng)開發(fā)的抗病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26的分子標(biāo)記進(jìn)行基因檢測。標(biāo)記見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥種質(zhì)材料的成株期抗病性表現(xiàn)

2016-2018年，對203份材料在病圃人工接種混合小種后，有121份材料表現(xiàn)出穩(wěn)定的成株期抗病性，剩余的82份材料表現(xiàn)感病。2018年在甘肅天水條銹菌越夏區(qū)和四川江油條銹菌冬繁區(qū)自然誘發(fā)條件下，分別鑒定出抗病材料170和179份，感病材料32和24份。人工接種鑒定和自然誘發(fā)鑒定結(jié)果的差異可能原因是接種的混合小種毒性強(qiáng)且毒性譜寬，而且人工接種保證了條銹菌的發(fā)病條件，有利于條銹菌侵染感病。通過綜合分析，在這兩種條件下成株期表現(xiàn)穩(wěn)定抗病的材料共107份，占材料總數(shù)的52.7%。

表1 小麥抗條銹病基因的分子檢測標(biāo)記Table 1 Molecular markers for the resistance genes to stripe rust

2.2 小麥種質(zhì)材料的苗期抗病性表現(xiàn)

苗期接種后，感病品種銘賢169對CYR32和CYR34均表現(xiàn)高度感病(反應(yīng)型為9)。Yr5和Yr15單基因系對兩個(gè)小種都呈現(xiàn)高度的抗性(反應(yīng)型為0)，Yr9、Yr17、Yr18單基因系對兩個(gè)小種都表現(xiàn)感病(反應(yīng)型為9)，Yr10和Yr26單基因系對CYR32表現(xiàn)抗病(反應(yīng)型為2)，卻對CYR34表現(xiàn)感病(反應(yīng)型為9)。成株期表現(xiàn)穩(wěn)定抗病的107份材料中, 對當(dāng)前流行小種具有苗期抗病性的材料共31份，其中對CYR32具有抗性的有3份，對CYR34具有抗性的共計(jì)29份，對CYR32和CYR34 都具抗性的為1份(表2)。

表2 ICARDA小麥抗源材料抗病性表現(xiàn)及分子檢測結(jié)果Table 2 Performance of resistance to stripe rust and the molecular detection in disease-resistant wheat materials from ICARDA

(續(xù)表2 Continued table 2)

編號Number小麥材料Wheat material苗期反應(yīng)型Seedling infection typeCYR32CYR34成株期抗病表現(xiàn)Infection type and disease severity at adult plant stage人工接種(楊凌)Artificial inoculation(Yangling)201620172018自然發(fā)病Natural induction天水Tianshui江油Jiangyou病評價(jià)Resistanceevaluation檢測基因Detected Yr genes53ICARDA-04399MR20MR20R5R10R5APRII9+1854ICARDA-04699R1R1R10MR20R10APRII9+1755ICARDA-05399R10R10R5MR20R5APRII1856ICARDA-05599R1R1R5MR20R5APRII17+?57ICARDA-05699MR10MR10R5R10R1APRII9+?58ICARDA-05799MR50MR50R10MR20R10APRII9+?59ICARDA-05899R1R1R10MR10R5APRII17+?60ICARDA-07199R1R1R5MR10R1APRII?61ICARDA-07299-MR50R5MR20R5APRII17+?62ICARDA-07699R5R5R5MR10R1APRII17+?63ICARDA-07799R10MR20R5R10R20APRII1864ICARDA-07999R10MR10R5R10MR10APRII17+?65ICARDA-08199R20MR20R10MR20MR20APRII9+1866ICARDA-08699R1R1R10MR10R1APRII17+?67ICARDA-09299MR10MR10MR20R5MR5APRII17+?68ICARDA-10099R5R5R5R10R1APRII1869ICARDA-10799MR20MR20R20R10R1APRII9+1870ICARDA-10899R10R10R5MR10R5APRII?71ICARDA-11099R10R5R5MR10R10APRII1872ICARDA-11397R10R10R5MR10R5APRII9+1873ICARDA-11497MR30MR30R5MR10R1APRII9+1874ICARDA-11599R10R10R5R10R1APRII9+1875ICARDA-11999R5R5MR10R10R5APRII17+1876ICARDA-12499R5R10MR20MR20R10APRII9+?77ICARDA-13297R0R0MR10MR20R1APRII17+?78ICARDA-13799R20MR50R10R20R5APRII9+1879ICARDA-13897R1R5R5R5R1APRII9+1880ICARDA-13999MR20MR50R10MR10R5APRII?81ICARDA-14099R30MR30R5MR10R5APRII?82ICARDA-14197R1R1R5R5R5APRII17+?83ICARDA-14299R5R5MR20R5R5APRII17+?84ICARDA-14699R5R5R1R5R1APRII9+1885ICARDA-14999R1R1R1R5R1APRII1886ICARDA-15099R20R40R10R10R5APRII?87ICARDA-15397R30MR30R10R5R1APRII?88ICARDA-15497MR30MR30R5R10R5APRII9+1889ICARDA-15597R0R1R1R5R1APRII9+1890ICARDA-15799R10MR20R5R10R1APRII9+?91ICARDA-15899MR30MR30R5R5R5APRII9+1892ICARDA-15999R10R10R5R5R5APRII9+1893ICARDA-16099R20R20R1R10R5APRII9+1894ICARDA-16197R10R10R1R5R1APRII9+1895ICARDA-16299R10MR30R5R5R5APRII9+1896ICARDA-16399MR20MR40R5R5R5APRII9+1897ICARDA-16598MR20MR20R5R5R5APRII9+1798ICARDA-16897R10R10R10R5R1APRII9+1899ICARDA-17099MR60MR60R10R10R5APRII?100ICARDA-17199R30MR40MR10R5R5APRII?101ICARDA-17299R10R20R10R1R5APRII9+?102ICARDA-18397R20MR40R10R5MR10APRII17+?103ICARDA-18699R5R5MR10R5R5APRII9+18104ICARDA-18799R5R5R10R5MR10APRII9+18105ICARDA-19299R20R20R5R10R10APRII18106ICARDA-19399R10R10R5R5R10APRII18107ICARDA-19799R1R1R5MR10R5APRII18

R:抗病;MR:中抗;MS:中感;S:感病;抗病類型后的數(shù)字代表嚴(yán)重度;APRI:苗期對參試小種表現(xiàn)抗病的成株抗病類型;APRII:苗期對參試小種表現(xiàn)感病的成株抗病類型;?:未檢測或未知基因。

R:Resistance; MR:Middle resistance; MS:Middle susceptible; S:Susceptible;Thedigitalsafter the letters of resistance types indicate the severity of materials. APRI:Types of disease resistance in adult stage with simultaneous seedling resistance; APRII:Types of disease resistance at adult stage susceptible to seedling disease; ?:Undetected or unknown genes.

2.3 小麥材料的抗條銹病基因分析

采用已開發(fā)出的抗病基因Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26的分子標(biāo)記，對具有穩(wěn)定成株抗性的107份材料進(jìn)行基因檢測，并結(jié)合抗譜分析推測其可能攜帶的抗病基因。結(jié)果表明，這些材料中，51份材料含有Yr9，2份材料含有Yr10，30份材料含有Yr17，56份材料含有Yr18，幾種基因以單獨(dú)或組合的方式存在。在這些材料中沒有檢測到Y(jié)r26，也沒有檢測到對我國當(dāng)前流行小種仍具有?；剐缘腨r5和Yr15。另外，Yr9和Yr17已對當(dāng)今流行小種不具有抗性，但在14份和18份材料中分別單獨(dú)存在這兩種基因，這些材料的成株期抗性是否因?yàn)槠浜衅渌礄z測到的新基因或基因組合，有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。Yr18是一個(gè)“一因多效”具有持久抗性的慢銹型基因，將其與具有加性效應(yīng)的微效基因結(jié)合在一起時(shí)能產(chǎn)生較高水平的抗性。在所檢測到的56份材料中，Yr18除單獨(dú)存在外，還以Yr9+Yr18、Yr17+Yr18、Yr9+Yr17+Yr18等多個(gè)基因聚合形式存在。有12份未檢測到任何基因，其可能含有未知的抗病基因，有待進(jìn)一步遺傳分析。

3 討 論

小麥抗源的篩選鑒定是培育抗病品種的基礎(chǔ)。國內(nèi)外在條銹病抗源收集、鑒定和新基因發(fā)掘等方面開展了大量研究，并取得了一系列重要研究成果[24-28]。截止2019年4月，國際上正式命名的抗條銹基因已有80多個(gè)(Yr1～Yr81)[29]。通過對國外引進(jìn)小麥種質(zhì)材料的抗病性鑒定，篩選對當(dāng)前小麥條銹病菌流行小種的有效抗源，可有效緩解因條銹病源菌新毒性菌系的不斷變異和發(fā)展及原抗病品種抗性“喪失”所帶來的小麥抗病育種壓力。ICARDA研究的重點(diǎn)地區(qū)為處在干旱條件下的西亞和北非，其育成的麥類品種難以直接應(yīng)用在我國主要麥區(qū)生產(chǎn)，但可作為種質(zhì)資源進(jìn)行新基因挖掘[30]。本研究作為初步的篩查工作，從203份ICARDA小麥種質(zhì)中選出107份對當(dāng)前流行頻率最大的CYR34和CYR32以及在春秋季菌源繁育基地自然發(fā)病圃中表現(xiàn)成株期抗性的材料。對這批材料的主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)需要做進(jìn)一步的調(diào)查和分析。

我國小麥條銹病抗源的使用主要是集中在為數(shù)不多的具有專化抗病基因的苗期抗病材料上，存在著難以直接應(yīng)用于品種改良和抗病基因“興衰周期”的問題[31]。目前，由于CYR34的流行，廣泛使用的Yr26等抗病基因正處于抗性喪失之中，仍具抗性的基因僅有Yr5、Yr15和Yr61[32]。本研究結(jié)果表明，107份具有穩(wěn)定成株期抗性的抗病材料中，95份攜帶已知抗條銹病基因或基因組合，主要包括Yr9(51份)、Yr10(2份)、Yr17(30份)、Yr18(56份)。值得關(guān)注的是，有些已知基因組合的材料的抗病性明顯提高，如Yr9+Yr17和Yr9+Yr18類型，意味著多基因聚合育種在某種程度上是有效的。未檢測到攜帶Yr5、Yr15、Yr26的抗病材料；12份抗條銹性表現(xiàn)良好的材料未檢測到任何基因，推測其可能攜帶如Yr30等目前尚未開發(fā)出良好篩查標(biāo)記的已知基因，或者攜帶新的抗病基因。因此應(yīng)加強(qiáng)抗病基因功能標(biāo)記開發(fā)工作，增加抗病基因分子檢測的數(shù)目，使基于標(biāo)記篩查的抗病基因分析更為精準(zhǔn)。在挖掘具有專化性的主效基因賦予抗性的抗源材料的同時(shí)，國內(nèi)外學(xué)者不斷拓寬抗源范圍，加強(qiáng)成株期抗病性、慢銹性、持久抗性的研究力度[33]。李孟凱等[34]已通過將Yr10、Yr18和Yr36基因轉(zhuǎn)育并聚合在小麥主栽品種中，從而獲得良好種質(zhì)資源。探索賦予此類抗病性的抗病基因數(shù)目或組合方式，以期讓育種家看到實(shí)現(xiàn)培育“一勞永逸”的持久性抗病品種的可能性，不再經(jīng)歷抗病良好的品種面臨抗性“周而復(fù)始”的喪失的厄運(yùn)。