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    染色體拷貝數(shù)變異測(cè)序(CNV-seq)對(duì)稽留流產(chǎn)絨毛組織的病因?qū)W檢查分析

    2019-08-22 11:02:44張卉祖淑靜張寧單飛楊威
    關(guān)鍵詞:核型三體畸變

    張卉 祖淑靜 張寧 單飛 楊威

    (哈爾濱市紅十字中心醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150076)

    稽留流產(chǎn)又稱過(guò)期流產(chǎn),指胚胎或胎兒已死亡滯留宮腔內(nèi)未及時(shí)自然排出者。胚胎或胎兒染色體異常是早期流產(chǎn)最常見(jiàn)的原因,約占50%~60%,染色體異常包括數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常。其中數(shù)目異常以三體綜合征居多,常見(jiàn)的有13、18、21、16和22-三體,其次為X單體,三倍體和四倍體少見(jiàn)。結(jié)構(gòu)異常引起流產(chǎn)并不常見(jiàn),主要有平衡易位、倒置、缺失、重疊及嵌合體等[1]。

    染色體拷貝數(shù)變異測(cè)序(copy number varaition sequencing,CNV-seq)是采用高通量測(cè)序(next generation seqencing,NGS)技術(shù)對(duì)樣本DNA進(jìn)行低深度全基因組測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果與人類(lèi)參考基因組堿基序列進(jìn)行對(duì)比,通過(guò)生物信息分析發(fā)現(xiàn)樣本存在的拷貝數(shù)變異(CNVs)。具有流程簡(jiǎn)單、易操作、通量高、兼容性好、所需DNA樣本量低等優(yōu)點(diǎn),樣本可為外周血、羊水、臍血、絨毛組織等[2]。為臨床檢測(cè)染色體疾病提供新的解決手段,可發(fā)現(xiàn)染色體非整倍體及染色體微缺失/微重復(fù)等。CNV-seq技術(shù)可用于產(chǎn)前診斷、流產(chǎn)原因排查、不孕不育原因查找,以及疑似染色體疾病患者的染色體異常檢測(cè)。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象 選擇2017年1月至2019年3月在哈爾濱市紅十字中心醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診臨床診斷的224例稽留流產(chǎn)患者,患者身體健康狀況良好,單胎。經(jīng)產(chǎn)前診斷門(mén)診遺傳咨詢自愿接受流產(chǎn)病因?qū)W檢測(cè)的患者,進(jìn)行檢測(cè)前咨詢,告知CNV-seq技術(shù)檢測(cè)目的及意義,行人工流產(chǎn)時(shí)留取絨毛組織送檢行CNV-seq。年齡在20~42歲,孕齡12周內(nèi)的患者。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 標(biāo)本的采集對(duì)臨床明確稽留流產(chǎn)的患者夫婦進(jìn)行檢測(cè)前的遺傳咨詢并簽署知情同意書(shū)。收集稽留流產(chǎn)患者的絨毛組織(無(wú)菌操作,無(wú)污染)取50~100g,放入生理鹽水中多次漂洗,漂洗至無(wú)血液成分,取黃豆粒大小的絨毛組織放入PE管密封管內(nèi),及時(shí)送檢。

    1.2.2 將采集到標(biāo)本送檢至北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司。

    1.3 CNV-seq實(shí)驗(yàn)方案及流程圖,詳見(jiàn)表1、圖1.

    表1 CNV-seq技術(shù)實(shí)驗(yàn)方案

    圖1 CNV-seq實(shí)驗(yàn)流程圖

    1 4 數(shù)據(jù)分析把檢測(cè)的DNA序列數(shù)據(jù)和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),得到樣本中每條染色體上可比對(duì)的唯一序列含量,根據(jù)生物信息學(xué)分析,計(jì)算出每條染色體的覆蓋深度值,并轉(zhuǎn)化為衡量染色體異常風(fēng)險(xiǎn)的指數(shù)。樣本中某一染色體DNA(chr N)所占總DNA比例可以表示為覆蓋深度Cov-chr N。然后對(duì)深度進(jìn)行修正,通過(guò)樣本染色體的Cov-ratio來(lái)判斷胎兒染色體拷貝數(shù)是否異常,統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的值為Cov-ratio值,Cov-chr N以及Cov-ratio值計(jì)算如下:覆蓋深度Cov-chr N=樣本染色體N上唯一序列片段總數(shù)/參考序列染色體N上唯一序列片段總數(shù);樣本的chr N的Cov-ratio=chrN的修正深度/平均修正深度;樣本的Cov-ratio值>1.3判定為樣本染色體重復(fù),Cov-ratio值<0.7判定為樣本染色體缺失。

    2 結(jié)果

    2.1 CNV-seq結(jié)果 224例稽留流產(chǎn)絨毛組織,檢測(cè)出染色體畸變114例,其中陽(yáng)性檢出率為51%(114/244) ,其中數(shù)目異常71例,占31.70%,其中包括特納綜合征20例、16-三體19例、22-三體7例、21-三體6例、13-三體3例、14-三體2例、20-三體1例、18-三體1例、15-三體1例、8-三體1例、4-三體1例、三倍體8例。詳見(jiàn)表2。

    表2 CNV-seq陽(yáng)性結(jié)果(染色體數(shù)目異常)

    2.2 CNV-seq結(jié)果根據(jù)測(cè)序及統(tǒng)計(jì)每條染色體的唯一序列片段所得出的結(jié)果分析,CNV-seq發(fā)現(xiàn)染色體畸變陽(yáng)性率為51%(114/224),單純數(shù)目異常為31.70%(71/224),嵌合體為3.12%(7/224),其它染色體畸變包含微缺失/微重復(fù)為16.07%(36/2224)。臨床意義不明的拷貝數(shù)目變異(Copy number variants of uncertain significance,VUS),即未確定性質(zhì)的已報(bào)道DNA異?;蛭匆?jiàn)報(bào)道的新變異,尚不能確定與其表型意義可能與稽留流產(chǎn)有無(wú)關(guān)系。詳見(jiàn)表3。

    表3 CNV-seq陽(yáng)性結(jié)果(染色體畸變除去數(shù)目異常以外嵌合體、部分微缺失/微重復(fù))

    注:高通量測(cè)序DNA測(cè)序查詢的數(shù)據(jù)庫(kù):DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源。

    3 討論

    3.1 稽留流產(chǎn)是胚胎停止發(fā)育未及時(shí)排除體外胚胎停止發(fā)育的主要原因之一是胚胎染色體異常,導(dǎo)致染色體異常的原因目前無(wú)明確定論,高齡是高危因素,與環(huán)境、感染、免疫、不良因素也有相關(guān)性。檢測(cè)胚胎染色體異常的方法有染色體核型分析、熒光原位雜交(FISH)、高通量DNA測(cè)序等技術(shù)。染色體核型分析常用G顯帶技術(shù)能夠檢查出絕大多數(shù)的染色體的異常情況,包括染色體數(shù)目異常如三體型、單體型、多倍體,染色體結(jié)構(gòu)異常如易位、倒位及10Mb以上的片段缺失、重復(fù)等。染色體核型分析應(yīng)用范圍廣、應(yīng)用時(shí)間較長(zhǎng),檢測(cè)結(jié)果比較受臨床醫(yī)師信賴,是對(duì)絨毛、羊水或臍血進(jìn)行產(chǎn)前診斷的主要方法和金標(biāo)準(zhǔn)。染色體核型分析技術(shù)檢測(cè)流產(chǎn)絨毛組織染色體的研究已經(jīng)比較深入。在國(guó)外,早在1975年就有學(xué)者報(bào)道了1500例自然流產(chǎn)組織樣本之后發(fā)現(xiàn)約有60%的絨毛染色體數(shù)目異常,主要為非整倍體和多倍體[3]。國(guó)內(nèi)學(xué)者們?cè)谌旧w核型分析技術(shù)檢測(cè)絨毛染色體方面也做了大量研究:歐陽(yáng)魯平等[4]利用傳統(tǒng)核型分析技術(shù)檢測(cè)了1160例早孕期流產(chǎn)絨毛樣本,檢測(cè)成功1140例,檢測(cè)成功率為98.2%,檢測(cè)出62例染色體異常核型,占5.44%,其中數(shù)目異常共32例(51.6%),以45,X最多見(jiàn),共 15例,其次是13-三體6例,結(jié)構(gòu)異常5例,嵌合體22例。本研究對(duì)224例稽留流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行CNV-seq檢測(cè),共檢測(cè)出71例數(shù)目異常,45,X最多見(jiàn),共20例,16-三體19例,22-三體7例也是導(dǎo)致流產(chǎn)的主要原因,這與孫義錫[5]的研究結(jié)果一致。與歐陽(yáng)魯平等[4]研究結(jié)果相近。CNV-seq比較核型分析技術(shù),對(duì)檢測(cè)標(biāo)本要求較低,分辨率及檢測(cè)成功率高,成為快捷、準(zhǔn)確、靈活的新型檢測(cè)手段[6]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的成熟與發(fā)展,全基因組測(cè)序被應(yīng)用到各種領(lǐng)域,尤其是遺傳性疾病的研究方面?zhèn)涫荜P(guān)注。目前人類(lèi)已知疾病中,大約有4000多種疾病與基因異常有關(guān)[7]。在傳統(tǒng)細(xì)胞遺傳學(xué)只能檢測(cè)5Mb以上的缺失和重復(fù),5Mb以下隱藏著眾多的微小不平衡,是細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)難以診斷的。

    3.2 FISH與傳統(tǒng)染色體核型分析技術(shù) FISH有著快速、高效等特點(diǎn),但也存在一定的局限性。FISH技術(shù)現(xiàn)階段只能針對(duì)已知的染色體非整倍體異常進(jìn)行檢測(cè),根據(jù)目前的研究,三體型可發(fā)生在除了1號(hào)染色體以外所有的染色體,而目前在臨床上使用的FISH探針只涉及13、16、18、21、22、X和Y這7條染色體,不能覆蓋所有染色體組,這將會(huì)漏診和誤診。臨床常用21、18、13、X、Y 五條探針。FISH技術(shù)只能檢測(cè)染色體的數(shù)目異常,并不能對(duì)染色體結(jié)構(gòu)異常進(jìn)行檢測(cè)。也不能檢測(cè)染色體微小變異,也就是說(shuō),F(xiàn)ISH檢測(cè)結(jié)果為陰性的樣本,并不能說(shuō)明該樣本不存在由易位、倒位、缺失及重復(fù)等結(jié)構(gòu)異常所導(dǎo)致的染色體核型異常。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,有15%~30%的核型異常是FISH不能檢測(cè)出來(lái)的[8]。FISH存在有一定的假陽(yáng)性率和假陰性率。有文獻(xiàn)進(jìn)行了大樣本的研究,分析了29039例樣本只有1例假陽(yáng)性(假陽(yáng)性率=0.003%)和7例假陰性結(jié)果(假陰性率=0.024%)[9]。

    3.3 CNV-seq 應(yīng)用本研究224例檢測(cè)成功率100%,陽(yáng)性樣本占總樣本率51%(114/224),低于范寶光等[10]研究的64.15%,徐蕾等[11]研究的79.59%。單純數(shù)目異常為31.70%(71/224),嵌合體為3.12%(7/224),其他染色體畸變包含微缺失/微重復(fù)為16.07%(36/2224)。文獻(xiàn)報(bào)道[12]流產(chǎn)染色體異常16-三體最多見(jiàn),其次21-三體和22號(hào)三體。Jiandong Shen等[13]采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)了 436 例流產(chǎn)絨毛樣本,檢出異常核型樣本 225 例,占 51.6%,包括188 例非整倍體異常,23 例片段微缺失微重復(fù),及 14 例三倍體。1978年顧世光報(bào)道,早期稽留流產(chǎn)中 30.5%~54.9%的流產(chǎn)兒具有異常染色體[14]。趙佳[15]等人對(duì) 1032 例大樣本流產(chǎn)絨毛樣本進(jìn)行檢測(cè),檢出異常核型445 例,異常率 43.12%。我們研究224例稽留流產(chǎn)患者中特納綜合征20例,16-三體19例,22-三體7例,21-三體6例,也是比較常見(jiàn),與文獻(xiàn)報(bào)道基本相符合。其次13-三體3例,14-三體2例,20-三體1例,18-三體1例,15-三體1例,8-三體1例,4-三體1例,三倍體8例。特納綜合征病例大多數(shù)在胚胎期流產(chǎn)。本研究檢測(cè)20%以上的染色體嵌合及染色體微缺失/微重復(fù)變異。其他染色體畸變包含微缺失/微重復(fù)為16.07%(36/224)。

    3.4 CNV-seq的優(yōu)勢(shì)與細(xì)胞培養(yǎng)核型分析相比其特異性、敏感性在檢測(cè)染色體數(shù)目異常上具有較高的一致性,能夠精確分析,利用Hiseq2500測(cè)序快速要得到結(jié)果,在時(shí)間上有較大優(yōu)勢(shì)。由于不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),減少了細(xì)胞培養(yǎng)失敗的可能性。相較于染色體核型分析和FISH技術(shù),采用高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)流產(chǎn)絨毛進(jìn)行檢測(cè)有以下幾方面的優(yōu)勢(shì)。第一,高通量測(cè)序又可稱為新一代深度測(cè)序,是指一次性能并行測(cè)序幾百萬(wàn)到十億條DNA分子,可對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行更深入、更全面、更細(xì)致的分析[16]。以Solexa技術(shù)為例,采用了該技術(shù)的Hi Seq 2500 測(cè)序儀,一臺(tái)機(jī)器在短短兩周的時(shí)間內(nèi)能產(chǎn)出超過(guò)300G 的數(shù)據(jù),這相當(dāng)于把人類(lèi)基因組重復(fù)測(cè)序100遍以上,短時(shí)間內(nèi)大輸出量的測(cè)序與以往技術(shù)相比較最突出的優(yōu)勢(shì)。第二,實(shí)驗(yàn)對(duì)樣本要求較低,即使絨毛樣本退化只要DNA含量達(dá)到一定的測(cè)序要求就能對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè),這就很大程度上提升了樣本的檢測(cè)成功率。第三,對(duì)于染色體結(jié)構(gòu)異常,該技術(shù)可檢測(cè)到100kb以上的染色體片段的微缺失和微重復(fù),提高了染色體異常的檢出率。而以往使用染色體核型分析技術(shù)只能排查出10Mb以上的染色體結(jié)構(gòu)異常,這就導(dǎo)致很多存在細(xì)微結(jié)構(gòu)異常的染色體被漏診,所以有學(xué)者認(rèn)為,早期自然流產(chǎn)絨毛的染色體異常率實(shí)際上應(yīng)該高于普遍報(bào)道的50%[17]。有文獻(xiàn)報(bào)道,通過(guò)大樣本量的研究,采用高通量檢測(cè)技術(shù)對(duì)智力低下的患者進(jìn)行遺傳學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)這些患者存在染色體結(jié)構(gòu)上的微缺失微重復(fù)[18]。

    3.5 CNV-seq結(jié)果解讀分析絨毛組織染色體畸變是否存在,如結(jié)果無(wú)異常時(shí),可以基本排除稽留流產(chǎn)非遺傳物質(zhì)染色體畸變所致,建議夫妻進(jìn)行其他檢查。流產(chǎn)原因還有精子畸形率、免疫、感染環(huán)境等等。如染色體畸變?yōu)榉钦扼w多數(shù)是生殖細(xì)胞成熟或受精卵早期卵裂過(guò)程中,染色體不分離或丟失等原因造成的[19]。稽留流產(chǎn)的病因可能與夫妻年齡、情緒、孕前孕期接觸有毒有害物理、化學(xué)、藥物等不良環(huán)境相關(guān)。如染色體畸變?yōu)槿笔?重復(fù),考慮拷貝數(shù)變異是新發(fā)突變還是來(lái)源于親本(夫妻之一),夫妻均需行CNV-seq檢測(cè)。無(wú)論是新發(fā)突變還是來(lái)源親本再次妊娠均需進(jìn)行遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷。

    總之,應(yīng)用CNV-seq對(duì)稽留流產(chǎn)絨毛組織染色體畸變進(jìn)行檢測(cè)能明確稽留流產(chǎn)的病因,有利于臨床醫(yī)師快速準(zhǔn)確尋找稽留流產(chǎn)病因,對(duì)再次妊娠有重要的指導(dǎo)意義。

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