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    MyD88在綿羊肺炎支原體感染過程中的作用

    2019-08-20 13:46:50張俊波印雙紅易萌陸安法
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2019年9期

    張俊波 印雙紅 易萌 陸安法

    摘要:為分析MyD88在綿羊肺炎支原體(MO)感染肺泡上皮細胞中的分子機制。用不同濃度的抑制劑ST2825與細胞孵育24 h,用MTT法檢測細胞活性;MO感染細胞后,于4、8、12、24 h收集細胞,利用實時定量PCR檢測MyD88 mRNA的表達水平。采用不同濃度的MyD88抑制劑ST2825與細胞孵育1 h,然后用MO感染細胞,于24 h收集細胞,利用實時定量PCR檢測白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA的表達水平,用試劑盒檢測caspase-3活性、caspase-8活性、H2O2濃度、NO濃度和LDH濃度變化。結(jié)果顯示,MO于4、8、12、24 h顯著提高細胞MyD88 mRNA表達水平;MO顯著提高細胞IL-8 mRNA水平、TNF-α mRNA水平、caspase-3活性、caspase-8活性、H2O2濃度、NO濃度和LDH濃度(P<0.01),而ST2825(濃度為10 μmol/L和20 μmol/L)能夠顯著降低MO介導的以上指標(P<0.05),表明MyD88在MO感染肺泡上皮細胞過程中發(fā)揮重要作用。

    關鍵詞:綿羊肺炎支原體;MyD88;致病機制

    中圖分類號:S858.26 文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2019)09-0197-04

    山羊傳染性胸膜肺炎是山羊的一種急性或慢性呼吸道傳染病,主要癥狀為纖維素性胸膜肺炎,此病可感染各種年齡的公母羊群,有很高的發(fā)病率和死亡率,被世界動物衛(wèi)生組織列入通報疫病名錄,我國將此病列為二類傳染病[l-4]。此病的臨床特征為:高熱、卡他性鼻液、眼結(jié)膜炎、纖維素性胸膜炎、母羊流產(chǎn)、消瘦等等。該病在世界范圍內(nèi)普遍流行,嚴重危害養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展,給養(yǎng)羊業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。山羊傳染性胸膜肺炎在我國流行時間較長,最早在甘肅發(fā)現(xiàn)有此病發(fā)生,隨后,在多個省份報道此病發(fā)生,例如在內(nèi)蒙古、四川、云南、江蘇等地[5]。在貴州的流行情況,2001年首次獲得絲狀支原體山羊亞種分離株[6],2011年首次獲得綿羊肺炎支原體分離株[7]。貴州白山羊的原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)位于銅仁市沿河縣,在山羊疾病中傳染性胸膜肺炎發(fā)病率和死亡率高,年齡在2歲內(nèi)的山羊較易感染,發(fā)病率為37.7%,病死率為36.4%[8]。此病已嚴重危害貴州養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展。

    TLRs是一類天然免疫受體,是高度保守的I型跨膜蛋白,為模式識別受體,是關鍵的天然免疫分子[9],主要在免疫細胞和上皮細胞上表達。它通過識別病原微生物的保守結(jié)構(gòu)發(fā)揮著重要作用,激活天然免疫細胞,導致一系列的機體炎癥反應,在機體抵御病原微生物侵襲上發(fā)揮重要作用。TLR樣受體信號通路介導多種生物學效應,如誘導炎癥因子釋放,誘導殺菌活性,促凋亡與抗凋亡作用等。MyD88是TLR信號通路中的關鍵接頭蛋白,在傳遞上游信息和感染疾病發(fā)生中至關重要。MyD88與心血管疾病、炎癥性腸病、腫瘤等疾病密切相關。

    目前,由于MO對山羊肺泡上皮細胞的作用機制尚不是很清楚,本試驗以探討MyD88在MO感染山羊肺泡上皮細胞中作用機制為目的,發(fā)現(xiàn)MyD88在MO對山羊肺泡上皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用,該研究為MO的致病機制研究提供理論基礎和參考意見。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 支原體與細胞

    綿羊肺炎支原體與山羊肺泡上皮細胞于2015年10月在銅仁市沿河縣康源白山羊生態(tài)養(yǎng)殖農(nóng)民專業(yè)合作社采集,然后將其保存于梵凈山特色動植物資源重點實驗室。

    1.1.2 試劑

    胎牛血清和DMEM細胞培養(yǎng)液,購自GIBCO公司;酵母提取物、蛋白胨,購自上海生工公司;Triton X-100細胞裂解液、MTT試劑盒和DMSO,購自北京索萊寶科技有限公司;caspase-3活性檢測試劑盒和ST2825抑制劑,購自Apexbio公司;LDH試劑盒,購自南京建成生物工程研宄所;SYBR染料,購于羅氏公司。

    1.2 方法

    1.2.1 MTT實驗

    收集對數(shù)期的山羊肺泡上皮細胞,用 0.25% 胰蛋白酶消化細胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個細胞懸液,以每孔103~104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔總體積為200 μL,邊緣孔用無菌的PBS填充。棄去上清,每孔加入150 μL DMSO溶液,置搖床上低速振蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解,在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處測量各孔的吸光度,具體操作見說明書。

    1.2.2 細胞處理

    (1)MyD88 mRNA檢測組:將細胞傳代于六孔板中培養(yǎng),當單層細胞生長至80%覆蓋度時,更換無雙抗的細胞培養(yǎng)液,支原體 ∶細胞按10 ∶1的比例感染細胞,在5% CO2、37 ℃環(huán)境中孵育。于4、8、12、24 h 4個時間點收集細胞;(2)TNF-α mRNA、IL-8 mRNA、Caspase-3活性、Caspase-8活性、H2O2濃度、NO濃度及LDH濃度檢測組:將細胞傳代于六孔板中培養(yǎng),當單層細胞生長至80%覆蓋度時,更換無雙抗的細胞培養(yǎng)液,將抑制劑不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h,然后,支原體 ∶細胞按 10 ∶1 的比例感染細胞,在5% CO2、37 ℃環(huán)境中孵育,于 24 h 收集細胞。

    1.2.3 實時定量PCR檢測MyD88、TNF-α、IL-8 mRNA

    MyD88 mRNA實時定量PCR檢測細胞樣品包括4、8、12、 24 h 4個時間點支原體感染組細胞及PBS對照組細胞。

    TNF-α、IL-8 mRNA實時定量PCR檢測細胞樣品包括24 h一個時間點支原體感染組細胞、支原體-抑制劑ST2825(5 μmol/L)組細胞、支原體-抑制劑ST2825(10 μmol/L)組細胞、支原體-抑制劑ST2825(20 μmol/L)組細胞及PBS對照組細胞。

    從NCBI網(wǎng)站GenBank查找MyD88、TNF-α、IL-8和 β-actin公布的基因序列,采用Primer 5.0軟件設計對特異性引物(表1),引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

    用Trizol一步法提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。內(nèi)參β-actin為對照,在羅氏LightCycler 480熒光定量PCR儀上進行相對定量的PCR反應,反應體系為:2×SYBR Green Master Mix 10 μL,cDNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,雙蒸水6 μL。PCR反應條件:95 ℃ 5 min預變性;95 ℃ 15 s,60 ℃ (MyD88、IL-8)或61 ℃(TNF-α、β-actin) 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。每組細胞每個時間點的細胞做3個重復,樣本基因MyD88、TNF-α、IL-8的表達強度用其對應的β-actin的量進行校正,即ΔCt=Ct(MyD88、TNF-α、IL-8)-CT(β-actin),相對表達量用2-ΔΔCT法對試驗數(shù)據(jù)進行分析。

    1.2.4 Caspase-3與Caspase-8活性檢測

    取細胞上清液,4 ℃,12 000 r/min離心8 min,按照試劑盒說明書檢測 Caspase-3和Caspase-8活性。

    1.2.5 H2O2濃度的測定

    把H2O2檢測試劑在冰上融解,在檢測孔加入50 μL樣品或標準品。在每個孔內(nèi)加入 100 μL H2O2檢測試劑。輕輕振蕩混勻,室溫放置30 min,然后立即測定D560 nm。計算出樣品中H2O2的濃度,具體操作按照試劑盒說明書進行。

    1.2.6 NO濃度的測定

    取細胞上清液,4 ℃,12 000 r/min離心7 min,按照說明書檢測NO濃度。

    1.2.7 LDH實驗

    取50 μL細胞上清液測LDH的D450 nm,按照說明書進行操作。

    1.2.8 統(tǒng)計學分析

    采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x[TX-*5]±s)描述,多組樣本間均數(shù)用方差分析,2組間比較采用2個樣本均數(shù)的t參數(shù)檢驗或q檢驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 抑制劑ST2825對肺泡上皮細胞活性的影響

    不同濃度(0、5、10、20 μmol/L)抑制劑ST2825與細胞作用24 h后,收集細胞,利用MTT方法檢測細胞活性,結(jié)果表明,當抑制劑ST2825濃度為5、10、20 μmol/L不影響細胞活性(圖1),可進行后續(xù)研究。

    2.2 對不同時間下MO感染肺泡上皮細胞的分析

    MO感染肺泡上皮細胞(MOI為10)后,提取細胞的總RNA,用實時定量PCR檢測MyD88的mRNA水平。感染時間為4、8、12、24 h,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在所觀察的時間點可以顯著提高MyD88 mRNA表達水平(圖2)。

    2.3 抑制劑ST2825對MO介導的H2O2分泌影響

    將不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h,用MO感染細胞,在24 h檢測胞內(nèi)MO對細胞引起的損傷情況,結(jié)果(圖3)顯示,MO可顯著提高H2O2分泌(P<0.01),抑制劑ST2825在 10 μmol/L 和20 μmol/L濃度下可以顯著降低MO介導的H2O2分泌(P<0.05),表明ST2825可以降低MO引起的細胞損傷。

    2.4 ST2825對MO介導的caspase-3和caspase-8活性的影響

    進一步檢測ST2825對MO介導的caspase-3和 caspase-8活性的影響,將不同濃度ST2825與細胞提前孵育1 h,再用MO感染細胞24 h,檢測caspase-3和caspase-8的活性。結(jié)果顯示,MO可極顯著提高caspase-3(圖4-A)和caspase-8(圖4-B)的活性(P<0.01),而ST2825在濃度 10 μmol/L 和20 μmol/L時能夠顯著降低MO介導的 caspase-3(圖4-A)和caspase-8(圖4-B)的活性(P<0.05)。

    2.5 ST2825對MO介導的TNF-α與IL-8 mRNA表達的影響

    由圖5可知,將不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h,用MO感染細胞,在24 h檢測胞內(nèi)MO對細胞TNF-α與 IL-8 mRNA的影響發(fā)現(xiàn),MO感染細胞組TNF-α(圖5-A)與IL-8(圖5-B)mRNA表達水平極顯著高于對照組(P<0.01),ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L濃度下可顯著降低MO介導的TNF-α(圖5-A)與IL-8 mRNA(圖5-B)表達水平(P<0.05),表明ST2825可以降低MO引起的炎癥因子 TNF-α與IL-8 mRNA的表達。

    2.6 ST2825對MO介導的NO的影響

    將不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h,然后,用MO感染細胞,在24 h檢測胞內(nèi)MO對細胞引起的損傷情況顯示,MO感染細胞組NO水平極顯著高于對照組(P<0.01),而抑制劑ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L濃度下可以顯著降低MO介導的NO分泌(P<0.05),NO是一個非常關鍵的信號分子,在細胞凋亡過程中起重要作用,結(jié)果表明抑制劑ST2825可以降低MO引起的凋亡相關基因NO的表達(圖6)。

    2.7 ST2825對MO介導的LDH的影響

    由圖7可知,將不同濃度的ST2825與細胞提前孵育1 h,用MO感染細胞,在24 h檢測培養(yǎng)液上清液中LDH水平,結(jié)果顯示,MO感染細胞組LDH水平極顯著高于對照組(P<0.01),而抑制劑ST2825在10 μmol/L和20 μmol/L濃度下可以顯著降低MO介導的LDH(P<0.05)。結(jié)果表明,MO可引起肺上皮細胞崩解,ST2825可以降低MO引起的細胞崩解度。

    3 討論

    TLRs屬于一種模式識別受體,可識別病原體的相關分子

    模式,識別的范圍很廣,主要包括脂質(zhì)類、碳水化合物和脂蛋白等結(jié)構(gòu),是連接非特異性免疫和特異性免疫應答的一個橋梁[10]。TLR4是TLRs其中的成員,它是通過活化前炎癥事件的一系列信號對病原生物所進行的應答,而脂多糖是TLR4配體有效的激動劑[11]。當被感染肺炎支原體后,就會激起宿主體內(nèi)的免疫應答[12],而天然免疫系統(tǒng)又是宿主抵御病原入侵的第一道防線,其中TLR在其中發(fā)揮著主要作用。支原體可激活宿主細胞Toll樣受體(TLR)信號通路,致使細胞釋放大量的TNF-α和IL-1等因子的釋放[13]。本研究表明,在抑制劑ST2825的作用下,可以抑制支原體介導的TNF-α mRNA表達水平。

    MyD88依賴性途徑是所有的TLR配體所介導的一個關鍵通路,而MyD88非依賴性途徑是TLR3和TLR4專有的信號傳導途徑的通路。MyD88與TLRs相互作用后,募集IRAK家族蛋白。但在外源刺激下由配體激活后,IRAK-4發(fā)揮致IRAK-1磷酸化的激酶作用,磷酸化的IRAK-1繼而與MyD88作用。此時,MyD88的TIR結(jié)構(gòu)域與受體發(fā)生結(jié)合,N端的DD結(jié)構(gòu)域與TRAF6、IRAK-1和IRAK-4復合體共同結(jié)合至受體上。而IRAK-1和TRAF-6發(fā)生磷酸化反應活化后與MyD88發(fā)生解離反應。

    caspases家族存在于絕大多數(shù)哺乳類細胞中,其中caspase-3與caspase-8在caspase級聯(lián)反應中作用至關重要,是導致細胞凋亡的關鍵途徑和所有凋亡信號傳導的共同通路[14-15]。caspase-8是細胞凋亡步驟中的起始因子,可以直接活化下游效應分子caspase-3。而caspase-3位于細胞凋亡級聯(lián)反應的下游,也是細胞程序性死亡的關鍵因子[16]。本試驗結(jié)果顯示,MO可顯著提高caspase-3的活性,而ST2825能夠顯著降低caspase-3的活性,消弱MO對 caspase-3活性的促進作用。

    不同濃度下的NO存在促進細胞凋亡和抑制細胞凋亡雙重作用。己有研究發(fā)現(xiàn)支原體不僅介導宿主發(fā)生免疫反應,同時也可引起單核細胞和巨噬細胞壞死或凋亡發(fā)生[17]。細胞凋亡是通過級聯(lián)反應與細胞因子變化致細胞死亡的過程。NO作為參與宿主各種生理和病理過程的多功能因子,低濃度的NO,可保護細胞免受凋亡,但NO的分泌過多可導致多種類型細胞發(fā)生凋亡。此外,多種支原體能夠通過分泌過量NO來誘導細胞凋亡[18-19]。而NO的表達是由低劑量抑制因子一氧化氮合酶(NOS)所控制的[20],過量的NO與超氧陰離子自由基形成過氧亞硝酸鹽,從而活化細胞凋亡的級聯(lián)反應[21]。

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