組蛋白乙?；敢种苿?DCH36_06)對小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究

彭金金 黃鶴鳴 劉彥君 石翠翠 范建高 張元元 羅成 李光明

急性肝損傷(acute liver injury, ALI)臨床十分常見，目前尚無有效防治方法。盡管引發(fā)ALI的病因各異，但均有炎性反應(yīng)參與其損傷修復(fù)過程，且炎性反應(yīng)可能是決定ALI臨床結(jié)局的關(guān)鍵[1, 2]。ALI病情進(jìn)展除與損傷強(qiáng)度及持續(xù)時間(環(huán)境因素)有關(guān)外，也與宿主的易感體質(zhì)(遺傳因素)密切相關(guān)，因此表觀遺傳在ALI病情演進(jìn)中可能起關(guān)鍵作用。組蛋白的乙?；揎検且环N重要的表觀調(diào)控方式[3]。P300/CBP組蛋白乙?；?histone acetyltransferase，HAT)與促炎因子表達(dá)上調(diào)及炎癥信號通路活化密切相關(guān)[3]。DCH36_06是新近發(fā)現(xiàn)的一種P300/CBP組蛋白乙酰化酶抑制劑，其可能具有抗炎活性[4]。基于炎性反應(yīng)在ALI病情進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，DCH36_06可能對ALI具有保護(hù)作用。本研究探討DCH36_06對脂多糖/D-氨基半乳糖胺(Lipopolysaccharide/D-galactosamine，LPS/D-Gal)誘導(dǎo)的ALI小鼠的保護(hù)作用，并初步闡明其機(jī)制。

材料與方法

一、 動物、試劑與藥物

C57BL/6雌性小鼠75只，8～10周齡，SPF級，體質(zhì)量20～22 g，購自中國科學(xué)院上海藥物研究所，在清潔級動物實驗中心喂養(yǎng)(標(biāo)準(zhǔn)動物飼料及飲水，12 h明暗交替光照時間)。所有動物實驗均遵守中國科學(xué)院上海藥物研究所動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。LPS(E.Coli，菌株O111：B4)和D-Gal均購自美國Sigma公司。DCH36_06試劑由中國科學(xué)院上海藥物研究所提供。蘇木素-伊紅(HE)和末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleotidyl transferase media-ted nick end labeling，TUNEL)染色試劑盒購自武漢谷歌生物科技有限公司。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-qPCR熒光染料試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。ELISA試劑盒購自美國Sigma公司。

二、 動物分組及小鼠ALI模型的建立

將75只小鼠隨機(jī)分成4組，正常對照組20只、ALI模型組20只、藥物干預(yù)組20只和藥物對照組15只。正常對照組：0.9%氯化鈉溶液0.5 mL腹腔注射，1 h后注射0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液；模型組：0.9%氯化鈉溶液0.5 mL腹腔注射，1 h后注射溶解有LPS(2 mg/kg)/D-Gal(250 mg/kg)的0.9%氯化鈉溶液0.1 mL；藥物干預(yù)組：DCH36_06(100 mg/kg)0.5 mL腹腔注射，1 h后注射溶解有LPS/D-Gal(劑量同模型組)的0.9%氯化鈉溶液0.1 mL；藥物對照組：DCH36_06 (劑量同干預(yù)組) 0.5 mL腹腔注射，1 h后注射0.1 mL 0.9%氯化鈉溶液。前3組于LPS/D-Gal誘導(dǎo)4 h后每組各處死5只取材，余小鼠繼續(xù)飼養(yǎng)至24 h，用以觀察各組小鼠24 h存活情況。

三、血生化水平檢測

使用日立7020全自動血生化分析儀，檢測血清AST、ALT、TBil水平。

四、 肝組織染色

(一)HE染色 肝組織浸泡于4%的多聚甲醛，室溫固定48 h后，脫水、浸蠟、包埋，切成約為5 μm厚度的切片。依次將切片放入二甲苯孵育140 min、無水乙醇孵育20 min、75%乙醇孵育5 min，三蒸水洗滌。蘇木精染色5 min后，于鹽酸水溶液中浸泡數(shù)分鐘，氨水水溶液中反藍(lán)，三蒸水洗滌。再將切片依次置于85%、95%的梯度乙醇中脫水后，蘇木精染液中染色5 min，三蒸水洗滌，而后脫水封片。

(二)TUNEL染色 將固定于4%多聚甲醛中的肝組織脫水、浸蠟、包埋，切成約為5 μm厚度的切片。按照試劑盒使用說明，制備反應(yīng)液并進(jìn)行染色孵育，依次經(jīng)converter-POD試劑37 ℃暗濕盒中孵育30 min， DAB底物室溫孵育10 min后，漂洗干燥、酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

五、肝組織細(xì)胞因子蛋白含量檢測

組織裂解液提取肝組織總蛋白后， ELISA法檢測肝組織細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白含量。經(jīng)過包被、封閉、洗滌、加樣、溫育、抗體孵育、洗滌、酶結(jié)合、顯色、終止反應(yīng)后，于酶標(biāo)儀450 nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔A值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和A值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算出各樣本濃度。

六、肝組織細(xì)胞因子mRNA水平檢測

七、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組小鼠24 h存活情況

在LPS/D-Gal刺激后，模型組小鼠早期即出現(xiàn)死亡，15只小鼠24 h存活6只；而DCH36_06干預(yù)組小鼠死亡時間明顯推遲，且24 h存活13只；空白對照組和藥物對照組的15只小鼠24 h均存活。實驗表明，DCH36_06對LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALI小鼠具有顯著保護(hù)作用，且無明顯肝毒性。

二、各組小鼠肝組織炎性損傷和肝細(xì)胞凋亡情況

正常對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀有序排列成肝索結(jié)構(gòu)；LPS/D-Gal誘導(dǎo)4 h后模型組小鼠肝細(xì)胞大片壞死，肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，正常肝索結(jié)構(gòu)消失，大量炎性細(xì)胞浸潤；藥物干預(yù)組小鼠肝細(xì)胞變性、壞死明顯減少，肝索結(jié)構(gòu)基本正常，炎性細(xì)胞浸潤明顯減輕，見圖1。TUNEL染色顯示，ALI模型組小鼠肝組織見大量肝細(xì)胞凋亡，與模型組相比，藥物干預(yù)組小鼠肝組織內(nèi)肝細(xì)胞凋亡顯著減少，見圖2。染色結(jié)果從組織學(xué)水平證實DCH36_06對LPS/D-Gal誘導(dǎo)的ALI具有顯著保護(hù)作用。

圖1各組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)(HE，低倍放大)A.正常對照組 B.ALT模型組 C.DCH36-06給藥組

圖2各組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)(TUNEL，低倍放大)A.正常對照組 B.ALT模型組 C.DCH36-06給藥組

三、各組小鼠血清AST、ALT、TBil水平

LPS/D-Gal刺激誘導(dǎo)模型組小鼠血清AST、ALT、TBil水平較正常對照組顯著升高(P<0.05)；而DCH36_06干預(yù)后小鼠血清AST、ALT、TBil水平較ALI模型組顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠肝功能指標(biāo)比較(±s)

四、各組小鼠肝組織炎性細(xì)胞因子mRNA水平和蛋白含量

與正常對照組相比，ALI模型組小鼠肝組織內(nèi)促炎性細(xì)胞因子TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；DCH36_06干預(yù)組肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平亦有輕微增高，但與模型組相比，炎性細(xì)胞因子mRNA水平顯著下降(P<0.05)，見表2。促炎性細(xì)胞因子 TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白含量的ELISA分析也顯示類似的結(jié)果，見表3。以上數(shù)據(jù)表明DCH36_06干預(yù)可有效抑制LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝組織炎性細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和炎性細(xì)胞因子的蛋白分泌，從分子水平證實DCH36_06對LPS/D-Gal誘導(dǎo)的肝組織炎性損傷具有顯著保護(hù)作用。

表2 各組小鼠肝組織內(nèi)促炎性細(xì)胞因子mRNA含量比較(±s)

表3 各組小鼠肝組織內(nèi)促炎性細(xì)胞因子蛋白含量比較(pg/mL,±s)

討 論

ALI本質(zhì)上是一種炎性損傷，適度的炎性反應(yīng)有助于損傷修復(fù)，過弱不利于病灶清除，過強(qiáng)易誘發(fā)損傷擴(kuò)大，導(dǎo)致疾病快速進(jìn)展。因此，精準(zhǔn)調(diào)控炎性反應(yīng)是防治ALI的關(guān)鍵。表觀遺傳可整合環(huán)境因素與宿主基因組遺傳信息，從源頭調(diào)控基因表達(dá)及炎性反應(yīng)[5]，提示干預(yù)表觀調(diào)節(jié)可能具有潛在肝臟保護(hù)作用。研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白乙?；揎椗c肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，P300/CBP組蛋白乙?；缸鳛橐环N重要的組蛋白修飾酶，在炎癥性疾病的進(jìn)展中起重要調(diào)控作用[6- 8]。

DCH36_06作為新發(fā)現(xiàn)的一種P300/CBP組蛋白乙?；敢种苿4]，可能對ALI具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，DCH36_06干預(yù)可顯著提高LPS/D-Gal誘導(dǎo)ALI小鼠24 h的存活率。為了探究DCH36_06對小鼠ALI的保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步從組織病理學(xué)及血清生化學(xué)方面證實了DCH36_06可顯著減輕LPS/D-Gal誘導(dǎo)的小鼠ALI，表現(xiàn)為肝組織炎癥性壞死、炎性細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞凋亡顯著減少，血清ALT、AST及TBil明顯降低。從分子生物學(xué)角度發(fā)現(xiàn)，DCH36_06干預(yù)可顯著下調(diào)小鼠肝組織促炎細(xì)胞因子TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)和蛋白分泌。

本研究證實P300/CBP組蛋白乙?；敢种苿〥CH36_06對小鼠ALI具有顯著保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)、減輕肝內(nèi)炎性反應(yīng)相關(guān)。研究結(jié)果顯示，表觀抑制劑可從源頭調(diào)控炎性反應(yīng)強(qiáng)度，由此減輕肝組織炎癥損傷，提示表觀抑制劑DCH36_06在防治ALI中可能具有潛在應(yīng)用價值，表觀調(diào)控可能是ALI防治的一個新靶點(diǎn)。