改良抗酸染色聯(lián)合CPA在基層醫(yī)院診斷肺結(jié)核中的應(yīng)用價值

徐加譽，樊春卉，譚 萍

(深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518081)

我國基層醫(yī)院檢驗室和實驗室承擔(dān)著主要的肺結(jié)核疾病發(fā)現(xiàn)任務(wù)，但在檢測肺結(jié)核疾病上存在一定局限性，以往多采用的病原學(xué)檢驗檢驗肺結(jié)核疾病，主要為MTB培養(yǎng)、痰涂片鏡檢，前者耗費檢測時間，無法滿足疾病診療需求，后者敏感性差，漏診可能性大[1]。隨著結(jié)合分支桿菌基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，醫(yī)學(xué)界建立了多種采用核酸檢測技術(shù)篩查判定結(jié)核病的方式，如恒溫核酸擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增(TMA)、多色熒光巢式PCR、實時熒光定量PCR等[2]。其中恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)為研討熱點，其應(yīng)用前景較好。已有研究[3]明確指出，通過交叉引物恒溫擴(kuò)增(CPA)的檢驗對基層醫(yī)院診斷肺結(jié)核有利。本文旨在分析改良抗酸染色聯(lián)合CPA在基層醫(yī)院診斷肺結(jié)核中的臨床應(yīng)用價值。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2016年5月至2019年2月深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院收治的經(jīng)臨床確診的肺結(jié)核[4]患者45例，男23例，女22例，年齡18～68歲，平均(41.5±0.5)歲。痰涂片鏡檢陰性標(biāo)本34例，陽性標(biāo)本11例。

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器

Xpert MTB/RIF檢測系統(tǒng)與試劑盒、結(jié)核分支桿菌核酸檢測試劑盒、萋尼抗酸染液、普通光學(xué)顯微鏡、細(xì)胞涂片離心機(jī)。

1.2.2 檢測方法

改良抗酸染色法：取痰液標(biāo)本1 mL，根據(jù)痰液性狀加入NaOH 10%(加入量為標(biāo)本體積的2倍)，振蕩讓其液化，取標(biāo)本1 mL，離心處理15 min并制片，室溫下將其晾干，火焰固定后，把待檢玻片放在玻璃槽內(nèi)，加Triton-X100 0.2%，在4 ℃環(huán)境中放置0.5 h，將玻片取出，做沖片處理，晾干后做抗酸染色處理。

CPA檢驗：在實施CPA檢驗的過程中，須嚴(yán)格按照CPA檢驗的相關(guān)流程以及要求對其實施臨床檢驗，避免出現(xiàn)錯誤。

CPA技術(shù)聯(lián)合改良抗酸染色法，先行改良抗酸染色法檢測，再行CPA檢測。

Xpert MTB/RIF技術(shù)檢測：取痰標(biāo)本5 mL，加入到離心管內(nèi)(50 mL)，再加入與標(biāo)本體積相等的NaOH 2%，振蕩讓其液化，放置15 min，加入PBS液至45 mL，離心處理15 min，轉(zhuǎn)速為3000 r·min-1，分離上清，再加入PBS洗滌液3 mL，確保pH=6.8。取經(jīng)處理過的痰液標(biāo)本1 mL，并將這一標(biāo)本加入到已經(jīng)處理后的試管中，在試管中再加入2 mL的處理液，震蕩處理15 min。取處理后的樣本2 mL，加入到反應(yīng)盒內(nèi)，并將反應(yīng)盒置入檢測模塊內(nèi)，提取核酸，并做擴(kuò)增處理，檢測結(jié)果。

1.2.3 觀察指標(biāo)

比較Xpert MTB/RIF技術(shù)、CPA技術(shù)聯(lián)合改良抗酸染色法、CPA技術(shù)、改良抗酸染色法檢驗其痰液標(biāo)本這4種方法的檢驗結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料的比較采用t檢驗，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

痰涂片鏡檢陽性標(biāo)本，4種檢查方式陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；痰涂片涂陽標(biāo)本，改良抗酸染色法陽性率為20.59%，明顯低于改良抗酸法+CPA技術(shù)(58.82%)、CPA技術(shù)(47.06%)、Xpert MTB/RIF技術(shù)(55.88%)(P<0.05)。見表1。

45例標(biāo)本中，改良抗酸染色法陽性率為33.33%，明顯低于CPA技術(shù)聯(lián)合改良抗酸染色法(62.22%)、CPA技術(shù)(53.33%)、Xpert MTB/RIF技術(shù)(64.44%)(P<0.05)。見表1。

表1 涂陽性標(biāo)本和涂陰性標(biāo)本4種檢測方法的結(jié)果

*P<0.05，#P<0.05與其他3種方法比較。

3 討論

肺結(jié)核指因感染結(jié)核分枝桿菌(MTB)而導(dǎo)致的慢性傳染性疾病，對人類身體健康有嚴(yán)重危害。近幾年來，因人口流動率大、艾滋病發(fā)病率高等因素影響，肺結(jié)核疾病發(fā)病率也日益增高，此疾病防治問題已較為嚴(yán)重[5]。感染結(jié)核菌者，癥狀多樣，臨床診斷難度大。實驗室檢查結(jié)果對臨床有效診治結(jié)核病意義重大。

以往臨床應(yīng)用頻率較高的則為痰涂片鏡檢，但檢出率<30%，漏檢可能性大，且無法區(qū)分死菌與活菌，無法滿足臨床診治的需求。痰涂片鏡檢經(jīng)改良后則形成了傳統(tǒng)痰涂片鏡檢，先處理痰液標(biāo)本后，確保完全釋放被包裹的結(jié)核分枝桿菌，再用玻片做離心處理，有效濃集標(biāo)本內(nèi)抗酸桿菌，然后做相應(yīng)的破壞細(xì)胞膜處理，讓菌體染色，并在染色完成后能夠?qū)⑵錂z測到[6-7]。

本研究中，傳統(tǒng)抗酸染色鏡下結(jié)核分枝桿菌密度小，需更多視野確定陽性和陰性。尤其需要注意的是，在實際的檢驗過程中的細(xì)菌密度較大，檢測效率也較高，相比傳統(tǒng)染色環(huán)境雜質(zhì)較多的缺陷有著更多優(yōu)勢，采用改良抗酸染色法進(jìn)行檢測時，所加入的NaOH對痰液標(biāo)本內(nèi)蛋白成分有降解作用，避免發(fā)生假陽性、假陰性[8-9]。目前，痰涂片抗酸桿菌檢驗，為細(xì)菌學(xué)檢測技術(shù)中最符合成本效益原則的方式[10-11]。但因分子生物學(xué)技術(shù)逐步改進(jìn)，較多的分子診斷技術(shù)在結(jié)核分支桿菌檢測中得到應(yīng)用，CPA則為其中一種，其將核酸試紙條檢測、核酸雜交、結(jié)核分支桿菌DNA擴(kuò)增融為一體[12]，此方式簡單快速，僅需2.5 h則可完成檢驗，且費用低，目測則可觀察到結(jié)果，成本費用低。Xpert MTB/RIF技術(shù)屬于WHO組織推出的新型分子檢測方式，從目前的評估研究中來看，此方式特異性和敏感性均較高，本研究中此方式檢測陽性率為64.44%，提示此方式檢測涂陰性、涂陽性標(biāo)本的檢出率較高?，F(xiàn)我國Xpert MTB/RIF技術(shù)仍然處于初期，檢測耗材較高、儀器昂貴等對此方式的推廣局限性較大。

本研究中，45例標(biāo)本，改良抗酸染色法陽性率為33.33%，明顯低于CPA技術(shù)聯(lián)合改良抗酸染色法(62.22%)、CPA技術(shù)(53.33%)、Xpert MTB/RIF技術(shù)(64.44%)(P<0.05)。總之，Xpert MTB/RIF技術(shù)、CPA技術(shù)聯(lián)合改良抗酸染色法、CPA、改良抗酸染色法檢驗均對臨床診治肺結(jié)核疾病有輔助性作用，且改良抗酸染色法聯(lián)合CPA可代替Xpert MTB/RIF檢測方式，節(jié)約檢驗成本，基層醫(yī)院則可滿足應(yīng)用和推廣條件。