基于腎藏精理論對(duì)魚鰾治療男性不育癥的實(shí)驗(yàn)研究?

劉美琪，湯軼波，鄭燕飛，白 雪，譚天陽，李 月，李韻歆，馬 茹，陳亞飛，劉振權(quán)△，王 琦△

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488； 2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029)

近年來，我國(guó)男性精子質(zhì)量普遍下降，男性不育已成為全社會(huì)普遍關(guān)注的問題[1]。研究發(fā)現(xiàn)，少弱精、無精患者約占男性不育的48.49%[2]。發(fā)展中國(guó)家和工業(yè)化國(guó)家生育率的逐漸降低，雖然部分歸因于社會(huì)經(jīng)濟(jì)和文化的改變，但環(huán)境對(duì)男性生殖系統(tǒng)的損害仍是其中不可忽視的重要因素[3]；男性生殖系統(tǒng)對(duì)環(huán)境暴露十分敏感，現(xiàn)代化生活中的工業(yè)污染、不良習(xí)慣、電子設(shè)備輻射等均與男性生殖功能受損直接相關(guān)[4-5]。男性不育患者社會(huì)壓力大、家庭關(guān)系緊張[6]，因此男性不育癥的防治已成為社會(huì)公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的幾大挑戰(zhàn)之一。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎藏精，主生殖，治療男性不育應(yīng)以補(bǔ)腎論治。專長(zhǎng)治療男科疾病的國(guó)醫(yī)大師王琦教授認(rèn)為，男性不育的主要病機(jī)為“腎精虧虛，兼夾病邪”[7]，其臨床治療少弱精子多加以中藥魚鰾組方，取得良好療效。

魚鰾性味甘平、入腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎益精、滋陰養(yǎng)血的功效，用于治療腎虛滑精所致的男性不育、腰膝酸軟[8-9]?！侗静萸笤酚涊d，魚鰾有“養(yǎng)筋脈，定手戰(zhàn)，固精”的功用[10]，現(xiàn)代《浙江省中藥炮制規(guī)范》是最早收錄魚鰾的炮制規(guī)定[11]。然而，魚鰾改善精子質(zhì)量的藥理實(shí)驗(yàn)研究目前尚少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過研究魚鰾對(duì)少弱精子小鼠精子質(zhì)量的改善作用，為臨床應(yīng)用魚鰾防治男性不育癥提供基礎(chǔ)研究支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD小鼠48只，體質(zhì)量18～20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供*許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006)。小鼠均自由飲水和采食，每天更換墊料及飼料，保持環(huán)境干燥清潔，環(huán)境溫度23±2 ℃。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)用藥及試劑 魚鰾：飲片購買于北京同仁堂北苑店；五子衍宗丸：購自北京同仁堂股份有限公司(批號(hào)17035273)。環(huán)磷酰胺：由Baxter Oncology GmbH生產(chǎn)(批號(hào)7J193A)；培養(yǎng)基M199(Life Technologies Corporation)(批號(hào)1917554)。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器 精子分析儀：清華同方3.0版，熱臺(tái)：DB-B2，徠卡微軟韋茨拉有限公司；移液器：Easypet3，艾本德中國(guó)有限公司北京分公司；天平：TE4101，北京賽多利斯儀器和系統(tǒng)工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、魚鰾低、中、高劑量組、五子衍宗丸組，每組各8只。除正常組外，其余各組小鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺60 mg/kg，持續(xù)5 d，建立少弱精子模型。從第6天開始，正常組和模型組以蒸餾水灌胃。魚鰾低、中、高各劑量組以人體等效劑量5、10、20倍用量灌胃魚鰾水煎液，分別為1.42 g/kg、2.85 g/kg、5.71 g/kg。魚鰾飲片水煎液制備方法為純凈水浸泡0.5 h，大火煎煮0.5 h。五子衍宗丸組以五子衍宗丸灌胃(1.71 g/kg)，每日1次，連續(xù)灌胃2周。末次給藥后，禁食12 h并處死小鼠，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2 睪丸與附睪指數(shù) 取小鼠睪丸和附睪稱重，計(jì)算睪丸重/體質(zhì)量和附睪重/體質(zhì)量。

1.2.3 測(cè)試精子質(zhì)量 根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]，用手術(shù)剪刀迅速分離附睪尾，并分離附睪尾上的脂肪組織，將附睪尾放入提前預(yù)熱37 ℃的M199培養(yǎng)基中，將附睪尾剪碎輕輕震蕩均勻，使精子充分游出。取10 μL精子懸浮液放入精子計(jì)板上，選取6個(gè)視野，于2 min內(nèi)完成測(cè)試。主要檢測(cè)指標(biāo)為精子濃度(×106/ml)、精子活力(%)、精子活率(%)、精子畸形率(%)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

表1顯示，腹腔注射環(huán)磷酰胺后，模型組小鼠精子濃度、精子活率與精子活力均顯著低于正常組(P<0.05)，精子畸形率與正常組比較顯著增加(P<0.05)，附睪指數(shù)、睪丸指數(shù)與正常組比較明顯下降(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示造模成功。

表1顯示，連續(xù)給藥2周后，五子衍宗丸組與魚鰾高、中、低各劑量組小鼠精子濃度、精子活率和精子活力均明顯高于模型組(P<0.05)，五子衍宗丸與魚鰾高、中劑量組小鼠精子畸形率較模型組有顯著降低(P<0.05)，五子衍宗丸與魚鰾高、中、低劑量組小鼠睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)顯著高于模型組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 魚鰾對(duì)少弱精子癥小鼠精子質(zhì)量的影響

注: 與正常組比較:#P<0.05; 與模型組比較:*P<0.05

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，少弱精子癥多由精索靜脈曲張、內(nèi)分泌失調(diào)、微量元素缺乏以及不健康的生活方式等因素導(dǎo)致[13]。精子濃度、精子活力、精子活率和精子畸形率為評(píng)價(jià)精子質(zhì)量的重要指標(biāo)，精子質(zhì)量越高說明受孕的幾率越大。其中精子濃度為每1 ml精子懸浮液中所含精子量；精子活力為樣品中向前運(yùn)動(dòng)精子占精子總數(shù)的百分比，即a級(jí)+b級(jí)精子占總精子的百分率；精子活率為樣品中運(yùn)動(dòng)精子占總精子數(shù)的百分率，即a級(jí)+b級(jí)+c級(jí)精子占總精子的百分率；精子畸形率表示精子形態(tài)發(fā)生變異的精子占總精子的百分率[14-15]。

環(huán)磷酰胺是烷化劑類抗腫瘤藥物，具有較強(qiáng)的免疫抑制作用，可對(duì)男性生殖系統(tǒng)造成損傷，導(dǎo)致精子染色體突變、無精癥或少精癥[16-17]。腹腔注射環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致小鼠精子畸形率升高，精子數(shù)、精子活力和生存能力明顯降低[18]；損傷大鼠睪丸組織形態(tài)，增大睪丸生精小管間隙，使各級(jí)生精細(xì)胞分布密度下降[19]。故本實(shí)驗(yàn)采用環(huán)磷酰胺制備少弱精子癥模型，經(jīng)腹腔注射環(huán)磷酰胺后，小鼠表現(xiàn)為精神萎靡不振，蜷縮畏寒，類似于中醫(yī)腎虛證；模型組精子濃度、精子活力、精子活率和精子畸形率較正常組明顯下降，與其他相關(guān)研究結(jié)果相符，由此可推測(cè)造模成功。

治療男性不育的相關(guān)研究進(jìn)展緩慢，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要應(yīng)用L-肉堿類和激素類藥物，但上述藥物單用效果不顯著，易產(chǎn)生藥物依賴，且激素副作用較大，臨床上應(yīng)用受到限制[20]?！端貑枴ち?jié)藏象論篇》記載：“腎者主蟄，封藏之本，精之處也?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為，腎為先天之本、藏精之處，腎氣是否充足、腎精是否充盈，與生殖機(jī)能的強(qiáng)弱息息相關(guān)；男性不育癥的病機(jī)常為腎虛，應(yīng)從補(bǔ)腎益精種子為主旨[21-22]。

魚鰾素有“海洋之參”的美譽(yù)，最初外用治療出血、瘡瘍，明清后主要用于補(bǔ)腎固精。清代《本草新編》有云：“魚鰾，味甘，氣溫，入腎經(jīng)。專補(bǔ)精益陰，更能生子。[23]”《外科大成》記載其“治遍身酸軟作痛者、腰痛”[24]?！侗静荽橐酚涊d：“線魚鰾，味甘咸，入足陰明經(jīng)，功專補(bǔ)益精氣。[25]”魚鰾更為“血肉有情之品”，具有滋陰補(bǔ)腎、填精養(yǎng)血的功效，臨床多用于治療腎虛封藏不固導(dǎo)致的夢(mèng)遺滑泄、腰膝無力。應(yīng)用魚鰾治療少精弱精癥的方劑亦有諸多記載，如《本經(jīng)逢源》記載了魚鰾膠入丸炮制方法，以及魚鰾與沙苑蒺藜組方而成的固精丸，用于腎虛不固、遺精滑泄[26]；《拔萃良方》收載的魚鰾丸在前者基礎(chǔ)上增添了當(dāng)歸、肉蓯蓉、蓮須與菟絲子，治療腎陰不足之癥[27]；《證治準(zhǔn)繩》中，聚精丸則較固精丸增加五味子，制蜜丸治療腎虛滑精[28]。

王琦針對(duì)男性不育疾病提出的“精室論”假說[29]，打破傳統(tǒng)中醫(yī)單純補(bǔ)腎的觀念，認(rèn)為精室為腎所屬，而與腎經(jīng)和督脈相通，主生精、泌精液；精室之病主要為精液病，包括少精、無精、弱精和精冷等。臨床少弱精子不育患者主要以腎陰、腎精虧虛為主，可兼有濕熱、瘀(精瘀血瘀)、毒(有害環(huán)境)或蟲(微生物感染)。王琦創(chuàng)制的男性不育主方“升精贊育湯”，方用生地黃、桑椹、枸杞以滋陰補(bǔ)腎，紫河車補(bǔ)腎益氣，巴戟天、仙靈脾溫陽化氣，茯苓、澤瀉以滲泄?jié)駸?，牡丹皮以涼血化瘀。在?shí)際辨證治療中，需結(jié)合患者具體癥狀對(duì)該主方進(jìn)行加減調(diào)整，尤其針對(duì)少弱精子者，為保契合病機(jī)，在前期補(bǔ)腎獲效后，常取“精血相生”之法調(diào)整組方，加入“血肉有情之品”，魚鰾膠以增強(qiáng)本方劑補(bǔ)益精血的功效，氣血并補(bǔ)，往往取得良好療效[30-31]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激是造成男性不育的原因之一[32]。魚鰾中膠原蛋白的含量高達(dá)80%左右，魚鰾明膠具有較強(qiáng)的抗氧化能力[33]，魚鰾中的蛋白水解產(chǎn)物也有抗氧化、抗疲勞的作用，可能印證魚鰾“補(bǔ)腎”的功效[34-35]。魚鰾是否通過抗氧化應(yīng)激等通路改善少弱精子，還有待進(jìn)一步研究。魚鰾中氨基酸含量豐富、種類全面，其中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和精氨酸等含量最高，這些氨基酸在臨床已被用于維持前列腺健康、治療少精弱精癥，為魚鰾“補(bǔ)腎益精”提供理論基礎(chǔ)[36]。

精子活力與精子活率都是衡量精子質(zhì)量的重要指標(biāo)，尤其精子活力表示向前運(yùn)動(dòng)精子的百分比，能夠更加直觀地反映精子質(zhì)量。在本研究中，魚鰾中、高劑量組小鼠的精子濃度、精子活率和精子活力與模型組比較均有顯著提升，表明魚鰾可以增加精子數(shù)量，提高精子運(yùn)動(dòng)活力，且成劑量相關(guān)性；此外，精子畸形表現(xiàn)為頭、體、尾的形態(tài)畸變，包括巨大頭、雙頭、體部折裂、卷尾、缺尾等[37]，臨床上畸形精子所占百分比用精子畸形率表示，超過30%時(shí)則為高畸形率精子，可對(duì)生育造成嚴(yán)重影響[38]。本實(shí)驗(yàn)魚鰾中、高劑量組精子畸形率顯著降低，說明魚鰾也可能通過降低精子形態(tài)畸變改善男性不育癥，且隨著濃度增高，魚鰾降低精子畸形率的作用逐漸加強(qiáng)。魚鰾低劑量組的精子活力和精子畸形率未被改善，考慮原因可能是尚未達(dá)到合適的藥物治療窗。

臟器系數(shù)[39]是指實(shí)驗(yàn)動(dòng)物某臟器的質(zhì)量與體質(zhì)量的比值，臟器系數(shù)的降低提示該臟器發(fā)生萎縮或退行性病變。經(jīng)魚鰾干預(yù)后，小鼠睪丸系數(shù)和附睪系數(shù)[40]明顯增加，說明魚鰾對(duì)環(huán)磷酰胺引起的睪丸、附睪的病理損傷有一定改善。綜上所述，魚鰾可以明顯提升少弱精子小鼠的精子質(zhì)量，改善睪丸的退行性病變，對(duì)治療男性不育癥有較大的潛在價(jià)值，其藥理機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。