不同活血化瘀方劑對(duì)心衰大鼠心功能及MMP-2的影響?

張 洋，王志娟，張 艷，劉曉宇△，孔繁達(dá)

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，大連 116000； 2. 航天中心醫(yī)院，北京 100049；3. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110032； 4. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032)

心力衰竭(簡稱心衰) 是各種原因引起的心臟結(jié)構(gòu)和功能變化，即以心室重構(gòu)為主要改變的心臟泵血功能障礙，臨床上以肺循環(huán)瘀血和(或)體循環(huán)瘀血及組織血液灌注不足為主要表現(xiàn)[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族的重要成員，與心衰的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切；當(dāng)心衰發(fā)生時(shí)，MMP-2的表達(dá)和活性逐漸增強(qiáng)，MMP-2的含量水平與心衰進(jìn)程成正相關(guān)[2]。本實(shí)驗(yàn)研究選用ACEI類藥物中的賴諾普利作為陽性對(duì)照藥物，ACEI為治療心衰的基石類藥物，研究顯示ACEI可抑制心衰時(shí)MMP-2的表達(dá)，并通過抑制心室重構(gòu)及改善心功能達(dá)到防治心衰的作用[3-4]?；钛鲱愔兴幾鳛榕R床治療心衰的有效方藥，可顯著緩解心衰癥狀，改善心臟功能，提高患者生活質(zhì)量[5-6]。桃紅四物湯為活血化瘀類基礎(chǔ)方劑，血府逐瘀湯、補(bǔ)陽還五湯等諸多活血化瘀方劑均由此方化裁而來。目前鮮見活血化瘀方劑對(duì)心衰后心功能及MMP-2影響的相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在觀察不同活血化瘀方劑對(duì)心衰大鼠心功能及心肌中MMP-2的表達(dá)影響，從中篩選出療效突出的方劑，并探討其作用機(jī)制及靶點(diǎn)，為中醫(yī)藥防治心衰提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所需動(dòng)物由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供[SCXK(遼)2010-0001]。選用12周齡、普通級(jí)、健康、雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量220～260 g。

1.2 造模與分組

圖 1、2顯示，大鼠經(jīng)7 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后，按每100 g給予10%水合氯醛0.4 mL行腹腔注射麻醉。備皮后于左側(cè)第4肋間開胸，鈍性分離胸部肌肉，暴露肋骨，鈍性分離肋間組織剝離心包膜暴露心臟，于左冠狀動(dòng)脈前降支起點(diǎn)處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，重置心臟于胸腔，分層縫合胸壁。術(shù)后連續(xù)注射青霉素鈉3 d以預(yù)防感染。常規(guī)喂養(yǎng)1周后將飼料減半，同時(shí)每日游泳至其力竭，每日1次，共4周；行心臟超聲檢測大鼠左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，計(jì)算心臟指數(shù)(CI)；以LVEF≤50%或CI≤180 ml·min-1·kg-1作為心衰成功造模的標(biāo)準(zhǔn)[7-8]。將造模成功的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、賴諾普利組、桃紅四物湯組、血府逐瘀湯組、補(bǔ)陽還五湯組，未行冠脈結(jié)扎的大鼠為空白對(duì)照組，每組各10只大鼠。

圖1 空白對(duì)照組與造模后大鼠心臟超聲比較

1.3 藥物與給藥劑量

桃紅四物湯組由桃仁、紅花、當(dāng)歸、川芎、赤芍、熟地等中藥組成，補(bǔ)陽還五湯組由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎、紅花、桃仁等組成，血府逐瘀湯組由桃仁、紅花、川芎、赤芍、當(dāng)歸、生地、牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草等組成，中藥方劑制劑由天江藥業(yè)有限公司提供，處方中的全部藥材均符合《中國藥典》2010年版有關(guān)規(guī)定[9]。賴諾普利片(10 mg/片)產(chǎn)自信誼萬象藥業(yè)(國藥準(zhǔn)字H10960265)?？瞻讓?duì)照組與模型組灌胃蒸餾水3 mL/次，每日1次。各給藥組大鼠按人鼠劑量換算，給藥劑量(g/kg)=給出的人的劑量(g)×系數(shù)(0.018)/所求動(dòng)物體質(zhì)量(kg)[10]。各中藥組給藥為9.2 g生藥/kg，賴諾普利組給藥為1.5 mg生藥/kg，給藥組藥物均溶于3 mL蒸餾水中，每日1次灌胃，上述各組均灌胃6周。

1.4 檢測方法

給藥4周后行心臟超聲檢測各組大鼠的心功能，包括：左室收縮末期容積(ESV)、左室舒張末期容積(EDV)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、每搏輸出量(SV),遂處死全部大鼠，每只大鼠心臟按標(biāo)準(zhǔn)處理，取100 mg心肌組織標(biāo)本，于液氮中冷凍后再保存待測,分別用于免疫組化法及實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測心肌組織中MMP-2的表達(dá)。

1.4.1 心肌免疫組化學(xué)檢測 3%H2O2去離子水孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，磷酸緩沖液(PBS) 沖洗2 min×3次；分別滴加一抗MMP-2受體抗體(稀釋比例1∶300)，37 ℃孵育 1 h，PBS 沖洗2 min×3次；滴加兔抗山羊IgG抗體，室溫孵育30 min，PBS 溶液沖洗2 min×3次；DBA顯色，顯微鏡下觀察并控制反應(yīng)時(shí)間，待組織著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液；蒸餾水充分沖洗，蘇木精輕度復(fù)染，乙醇脫水、透明、中性樹膠封片。以心肌胞質(zhì)染成棕褐色為陽性細(xì)胞標(biāo)志，采用Imagepro-Plus 6.0圖像分析軟件測定心肌組織切片陽性表達(dá)區(qū)的積分光密度值(IOD)，取平均值作為IOD。

1.4.2 心肌實(shí)時(shí)定量PCR檢測 采用TRIZOL從心肌組織中提取總RNA(100 mg/mL)，提取方法嚴(yán)格按照說明書操作。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入RNA 2μg，10×RT Mix2μL，NTP混合液2 μL，OligodT152 μL，QuantReverse Transcriptase 1 μL，加入RNase-free水。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系在37 ℃下反應(yīng)60 min，在70 ℃下15 min使產(chǎn)物變性。合成的cDNA于-20 ℃下保存。MMP-2上游引物 5’-GAAGCATCAAATCGGACTG-3’，下游引物5’-GGCGGGAGAAAGTAGCA-3’，產(chǎn)物長度251 bp。PCR反應(yīng)條件均為:95 ℃預(yù)變性5 min 94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s,重復(fù)35個(gè)循環(huán)后,72 ℃ 5min。梯度稀釋的正常組cDNA，以各引物完成定量PCR反應(yīng)，再將各組cDNA進(jìn)行定量PCR檢測。實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用相對(duì)定量法。以2-ΔΔCt(Livak)法比較未經(jīng)處理樣品和已處理樣品目標(biāo)轉(zhuǎn)錄之間的表達(dá)差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能檢測結(jié)果

表1顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組ESV、EDV明顯升高，LVEF、SV明顯下降(P<0.05)；各給藥組ESV、EDV較模型組明顯下降,LVEF、SV明顯升高(P<0.05)。給藥組組間比較，補(bǔ)陽還五湯組較其他3組ESV、EDV明顯下降，LVEF、SV明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組大鼠MMP-2免疫組化IOD值及mRNA表達(dá)結(jié)果

表1圖2顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組心肌組織MMP-2的IOD值及mRNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；各給藥組MMP-2水平較模型組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥組組間比較，補(bǔ)陽還五湯組MMP-2的IOD值及mRNA水平較其他3組下降更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，空白對(duì)照組及各給藥組MMP-2的陽性表達(dá)明顯減少(P<0.05)；與補(bǔ)陽還五湯組比較，其他3給藥組MMP-2的陽性表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

表1 各組大鼠心功能、MMP-2免疫組化IOD值及mRNA表達(dá)結(jié)果

注：與空白對(duì)照組比較：▲P<0.05；與模型組比較：△P<0.05；與補(bǔ)陽還五湯組比較：#P<0.05

注：A.空白對(duì)照組；B.模型組；C.賴諾普利組；D.桃紅四物湯組；E.血府逐瘀湯組；F.補(bǔ)陽還五湯組圖2 (A～F) 各組大鼠心肌組織MMP-2免疫組化染色 (40×)

3 討論

“心衰”作為病名首見于西晉·王叔和《脈經(jīng)·脾胃部第三》：“心衰則伏，肝微則沉，故令脈伏而沉”[11]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的心衰與中醫(yī)文獻(xiàn)記載的心衰尚存在一定差異，屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹、水腫、喘證、心悸”等范疇。中醫(yī)古代文獻(xiàn)對(duì)于心衰的命名只是抓住了心衰的一些臨床癥狀進(jìn)行闡述，而不是將心衰作為一個(gè)獨(dú)立的疾病，不利于反映心衰作為一個(gè)疾病發(fā)生發(fā)展的全過程。目前多主張以“心衰病”命名，更有利于體現(xiàn)其疾病特征[12]。臨床中心衰以“血瘀”證候?yàn)橹饕憩F(xiàn)，“不通則痛”決定了心衰的病因病機(jī)主要為“血瘀”所致，故活血化瘀視為心衰的基礎(chǔ)治則。本研究選用桃紅四物湯、血府逐瘀湯及補(bǔ)陽還五湯作為研究藥物，三方均為活血化瘀類代表方劑。桃紅四物湯以祛瘀為核心，輔以養(yǎng)血行氣，使瘀血祛、新血生、氣機(jī)暢，化瘀生新為該方顯著特征。血府逐瘀湯與補(bǔ)陽還五湯皆由桃紅四物湯化裁而來。其中血府逐瘀湯主治諸癥皆為瘀血內(nèi)阻胸中、氣機(jī)郁滯所致，即王清任所稱“胸中血府血瘀”之證。補(bǔ)陽還五湯方中重用黃芪以補(bǔ)氣，使得氣帥血行；另配地龍引領(lǐng)活血化瘀諸藥貫通經(jīng)脈以達(dá)末節(jié)之地，故此方更偏于益氣活血、化瘀通絡(luò)。

心室重構(gòu)是心衰發(fā)生發(fā)展的核心機(jī)制。心室重構(gòu)是心室由于心肌損傷或負(fù)荷(壓力或容量)加重等因素，導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和心臟功能下降等一系列復(fù)雜的病生理過程。心室重構(gòu)主要表現(xiàn)為心室肥厚、心室腔擴(kuò)大等心肌結(jié)構(gòu)的改變[13]。本研究通過心臟超聲檢測大鼠心功能發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠ESV、EDV明顯升高，LVEF、SV明顯下降，說明心衰大鼠出現(xiàn)心室腔擴(kuò)大、左室增厚、心臟收縮功能下降等心肌結(jié)構(gòu)和功能改變，提示大鼠存在心室重構(gòu)。經(jīng)藥物治療后大鼠心肌結(jié)構(gòu)及功能均有明顯改善，表現(xiàn)為ESV、EDV明顯下降及LVEF、SV明顯升高，說明中藥桃紅四物湯、血府逐瘀湯、補(bǔ)陽還五湯和西藥賴諾普利在治療心衰過程中均起到了抗心室重構(gòu)和改善心功能的作用，且補(bǔ)陽還五湯效果優(yōu)于桃紅四物湯、血府逐瘀湯及賴諾普利。

研究表明，心衰時(shí)心肌組織中MMP-2的表達(dá)顯著增高，高表達(dá)的MMP-2可降解正常膠原組織，使心肌膠原網(wǎng)絡(luò)發(fā)生重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心室重構(gòu)惡化，從而加快心衰的進(jìn)程[14]。而通過下調(diào)心衰時(shí)心肌MMP-2的表達(dá)，可有效改善心功能，抑制心室重構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到治療心衰的作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，中藥桃紅四物湯、血府逐瘀湯、補(bǔ)陽還五湯和西藥賴諾普利均可下調(diào)心衰大鼠心肌中MMP-2的表達(dá)，其中補(bǔ)陽還五湯在下調(diào)心肌MMP-2的表達(dá)上優(yōu)于桃紅四物湯與血府逐瘀湯及賴諾普利。本研究表明，上述中藥活血化瘀方劑可通過改善心衰時(shí)受損的心臟功能及抑制心肌MMP-2的表達(dá)起到治療心衰的作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制心肌MMP-2活性，從而調(diào)節(jié)心肌膠原的分布及代謝，修復(fù)受損心肌組織，增強(qiáng)心肌的抗?fàn)坷院蛷椥?，從而提高心肌整體收縮力，改善心功能，抑制心室重構(gòu)，進(jìn)而達(dá)到治療心衰的作用。本研究佐證了“活血化瘀”治則在治療心衰中的重要意義，為“通則不痛”的中醫(yī)理論提供了科學(xué)客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。