腹部推拿對慢性疲勞綜合征模型大鼠行為學(xué)及海馬區(qū)BDNF、CREB mRNA表達的影響?

李華南，韓一豪，劉 洋，趙 祥，駱雄飛，王金貴，馬 菲

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院推拿科,天津 300193； 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193；3. 天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院科教科，天津 300120)

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)是指患者出現(xiàn)不明原因的嚴重倦怠感，可伴有頭痛、失眠、抑郁、食欲不振、體質(zhì)量下降、免疫功能受損、性功能低下等癥狀，影響正常工作的臨床綜合征[1-2]。目前在全世界范圍內(nèi)CFS的患病率是0.4%～2.6%，以20～40歲女性為主[3-4]。近年隨著生活節(jié)奏加快、工作壓力增大等原因，其患病率呈逐年上升趨勢。CFS作為社會性疾病，嚴重影響患者生活質(zhì)量，給患者家庭和社會帶來了沉重負擔(dān)。

目前，醫(yī)學(xué)界普遍認為CFS的發(fā)生與慢性應(yīng)激、心理、病毒感染、免疫功能失調(diào)等因素有關(guān)，而神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)失調(diào)可能是CFS發(fā)生的重要病機之一[5]。有研究表明，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)及環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP responsive element binding protein，CREB)作為與海馬神經(jīng)元可塑性密切相關(guān)的物質(zhì)，在應(yīng)激狀態(tài)下，上述蛋白基因表達遭受破壞，進而會影響海馬神經(jīng)元的數(shù)量、結(jié)構(gòu)和功能，從而誘發(fā)CFS。本項目擬以CFS大鼠為模型，以力竭游泳、曠場實驗等行為學(xué)評價方法作為效應(yīng)指標，觀察腹部推拿療效。同時，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)觀察其對海馬區(qū)BDNF和CREB mRNA表達的影響，探討腹部推拿干預(yù)CFS的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

健康成年雌性Sprague-Dawley大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司(實驗動物許可證書號SCXK(京)2014-004)，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實驗動物中心。

1.2 試劑及儀器

Trizol(invitrogen，美國)；Anti-BDNF、Anti-CREB(Abcam，美國)； M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 (Takara，日本)；RNA酶抑制劑 (Takara，日本)；正常熔點的瓊脂糖凝膠 (GIBCO，美國)；SuperRX感光膠片 (FUJIFILM，日本)；DYCP-31BM型水平、垂直電泳裝置 (北京市六一儀器廠，中國)；LabWorksTM凝膠成像及分析系統(tǒng) (UVP，美國)。

2 方法

2.1 動物分組

按隨機數(shù)字表法將已造模成功的CFS實驗大鼠分為腹部推拿組、模型對照組每組各10只。SD雌性大鼠10只為正常對照組。其中，腹部推拿組在造模成功后給予腹部推拿治療，模型對照組只造模、成功后不予治療，正常對照組則既不作造模也不給予腹部推拿干預(yù)。

2.2 制作CFS大鼠模型

參考相關(guān)文獻[6]采用懸吊游泳法復(fù)制CFS動物模型。每天上午懸吊，下午進行負重游泳，連續(xù)12 d。懸吊每3 d循序加量1次，時間分別為1 h、1.5 h、2h、2.5 h。游泳訓(xùn)練前3 d適應(yīng)性游泳30 min，以后為力竭性訓(xùn)練負重3%。力竭標準：游泳動作明顯失調(diào)，不能再堅持；沉入水下10 s不能回到水面。除正常對照組外，余余2組均采用上述方法制備 CFS模型。

2.3 腹部推拿方法

選用腹部推拿中核心手法“按法”“摩法”作為主要干預(yù)手法。為保證手法的一致性，實驗前應(yīng)用YF-3手法測定儀采集天津腹部推拿名家陳志華操作手法信息，對其手法的用力大小、頻率等進行標定，建立手法操作模型。實驗過程中手法由專人操作，手法操作者除掌握手法要點外，還需應(yīng)用YF-3 手法測定儀進行評測，待其手法的力度大小、頻率形成的波形軌跡與手法模型基本一致后，方可于實驗大鼠身上操作。取穴參考《實驗推拿學(xué)》[7]選取大鼠的關(guān)元穴、中脘穴。

腹部按法：手法操作者以右手食指、中指二指疊按置于關(guān)元穴上，余指并攏。以右手腕關(guān)節(jié)為支點，食、中二指掌指部主動施力，向恥骨聯(lián)合脊柱方向徐徐按下，力量自輕至重，待指面可感覺到大鼠腹部動脈輕微搏動，按而留之，完成此過程大約30 s，后維持此時的壓力及其所達到的深度，靜待1 min后手法操作者掌指部徐徐上提，直至完全離開受壓部位，此過程大約持續(xù) 30 s。如此反復(fù)操作2次，共4 min。

腹部摩法：手法操作者肘關(guān)節(jié)自然屈曲，腕部放松，指掌自然伸直，食指、中指并攏。以食指、中指指面著于施術(shù)部位，以腕關(guān)節(jié)為中心，連同掌、指作環(huán)形摩動，并以中脘穴為圓心，做順時針方向節(jié)律性環(huán)旋運動，頻率宜緩，每分鐘20～30次，如此反復(fù)操作6 min，每天治療1 次，連續(xù)治療14 d。模型對照組、正常對照組不給予任何干預(yù)手段。

2.4 觀察指標和測試方法

2.4.1 大鼠行為學(xué)檢測 力竭游泳實驗:在水深50 cm，水溫(25±1)℃的游泳池中行1次力竭游泳，以大鼠從入水游泳至頭部沉入水中10 s不能浮出水面的時間為力竭時間。鼠尾懸掛實驗:將距大鼠尾端1 cm的部位穿過中央鉆有直徑1 cm孔的一水平有機玻璃板，板離地面1 m，使動物呈倒掛狀，大鼠為克服不正常的體位而掙扎活動，但活動一定時間后出現(xiàn)間斷性停止掙扎顯示“失望”狀態(tài)，計算5 min內(nèi)的停止掙扎時間。曠場實驗:曠場箱為木質(zhì)箱，80 cm×80 cm×80 cm，內(nèi)壁涂黑，底面劃為25個面積相等的小方格。測試時，將大鼠置于曠場測試箱底面中心，觀察其5 min內(nèi)的行為。觀察指標：以大鼠穿越底面的方格數(shù)為水平得分，以后肢站立的次數(shù)為垂直得分。記錄各組動物水平活動和垂直活動得分。

2.4.2 海馬區(qū) BDNF、CREBmRNA表達的RT-PCR檢測 將各組大鼠斷頭，剝離大腦并分離出海馬，將剝離的海馬組織轉(zhuǎn)移到已清洗干凈并高溫烘干滅活RNA酶的凍存管中，立即投入液氮中，后移至-80 ℃冰箱。將上述組織樣品，分別加入TRIZOL試劑、氯仿、異丙醇后勾漿離心，移去上清液，每1mlTRIZOL試劑勾漿的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇，清洗RNA沉淀。震蕩離心后去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀，提取的RNA保存于-70 ℃冰箱中。后采用一步RT-PCR法，引物基因序列如表1，PCR儀中48 ℃孵育 45 min，94 ℃孵育 2 min后進入 PCR 循環(huán)，擴增產(chǎn)物于 4 ℃下保存。紫外透射儀上觀察電泳條帶并拍照。采用IPP6.0圖像處理軟件提取并計算條帶光密度值，以目的片段與內(nèi)參照(β-actin)擴增條帶的光密度積分值比值評定目的片段 mRNA 的表達水平。

表1 引物基因序列

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠行為學(xué)檢測結(jié)果

表2顯示，干預(yù)前腹部推拿組、模型對照組2組大鼠力竭游泳時間縮短，與正常對照組之間比較差異顯著(P<0.05)。干預(yù)2周后，腹部推拿組、模型對照組大鼠力竭游泳時間增加，與正常對照組之間比較差異顯著(P<0.05)。腹部推拿組大鼠力竭游泳時間顯著增長，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

同時，干預(yù)前腹部推拿組、模型對照組2組大鼠懸尾時間延長，與正常對照組之間比較差異顯著(P<0.05)。干預(yù)2周后，腹部推拿組、模型對照組大鼠懸尾時間縮短，與正常對照組之間比較差異顯著(P<0.05)。腹部推拿組大鼠懸尾時間顯著縮短，與模型對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

另外在曠場實驗運動次數(shù)方面，干預(yù)前腹部推拿組、模型對照組2組大鼠水平及垂直運動次數(shù)均減少，與正常對照組之間比較差異顯著(P<0.05)。干預(yù)2周后，腹部推拿組、模型對照組大鼠水平及垂直運動次數(shù)增加，與正常對照組之間比較差異顯著(P<0.05)。腹部推拿組大鼠水平及垂直運動次數(shù)增加顯著，與模型對照組比較差異差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠力竭游泳、鼠尾懸掛時間變化比較

注：與正常對照組比較:*P<0.05；與模型對照組比較：△P<0.05

3.2 各組大鼠海馬區(qū) BDNF、CREBmRNA表達比較

圖1表4顯示，干預(yù)2周后與正常對照組比較，腹部推拿組和模型對照組大鼠BDNF mRNA表達水平低于正常對照組(P<0.05)，腹部推拿組經(jīng)過干預(yù)后呈上升趨勢，但與模型對照組之間比較無明顯差異；與正常對照組比較，模型對照組大鼠CREB mRNA表達水平降低，差異明顯(P>0.05)，而腹部推拿組經(jīng)過干預(yù)后，CREB mRNA表達水平高于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組BDNF、CREBmRNA及β-actin mRNA 陽性擴增物電泳圖

組別鼠數(shù)BDNFCREB 腹部推拿組100.331±0.171?0.644±0.359△模型對照組100.272±0.191?0.421±0.159?正常對照組100.594±0.1880.830±0.126

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型對照組比較：△P<0.05

4 討論

CFS在古代中醫(yī)文獻中并無相應(yīng)記載，現(xiàn)代多認為屬“虛勞”范疇。脾胃功能失調(diào)是導(dǎo)致CFS 發(fā)生的主要原因之一[8]，病因病機多以脾胃先傷、運化升降失司致濕濁內(nèi)生，進而阻滯氣機、經(jīng)絡(luò)，最終使氣血不能灌溉四旁所為。正如《丹溪心法》所言：“脾胃受濕，沉困無力，怠惰好臥?！?/p>

腹部推拿作為中醫(yī)特色療法之一，治療CFS具有深厚的臨床研究基礎(chǔ)[9]。中醫(yī)認為腹部乃人體中樞，脾胃所居，氣機升降樞紐，腹部推拿可以調(diào)理人體脾胃升降，增強后天脾胃運化，補益氣血。同時，經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)的主要組成部分十二正經(jīng)和奇經(jīng)八脈亦循行、分布、絡(luò)屬于腹部。因此，日本漢醫(yī)湯本求真在其《皇漢醫(yī)學(xué)》中曾言：“腹者，生之本也，故百病以此為根?！薄吨笁函煼ā芬粫懈菑娬{(diào)“腹為萬病機”，并認為按摩腹部對于治療疾病深有影響[10]。這也為腹部推拿防治CFS提供了理論依據(jù)。

本實驗采用復(fù)合應(yīng)激方法復(fù)制CFS模型，模擬人體多重生理、精神應(yīng)激狀態(tài)，從而建立CFS大鼠模型。負重游泳包含體力消耗刺激、強迫心理刺激，懸吊則會使大鼠產(chǎn)生憤怒、掙扎、絕望等心理應(yīng)激，多重應(yīng)激會使大鼠產(chǎn)生精神和軀體雙重疲勞。造模后，應(yīng)用力竭游泳、鼠尾懸掛、曠場實驗等行為學(xué)評價方法證明了造模有效及成功。

行為學(xué)評價中，力竭游泳時間是反映大鼠體力狀況及疲勞的經(jīng)典指標。本實驗結(jié)果表明，模型組力竭游泳時間縮短，說明大鼠體力的疲勞、自發(fā)活動減少出現(xiàn)了抑郁傾向。腹部推拿干預(yù)后，大鼠力竭游泳時間明顯升高，說明腹部推拿可以緩解大鼠的疲勞狀態(tài)。鼠尾懸掛實驗是反映大鼠克服外界不良刺激的體力及心理疲勞的程度。研究結(jié)果表明，模型組大鼠停止掙扎時間明顯高于空白組，反映了大鼠的體力下降以及出現(xiàn)“失望”狀態(tài)，處于“心理疲勞”和“軀體疲勞”狀態(tài)。腹部推拿干預(yù)后，大鼠停止掙扎時間縮短，較模型對照組改善明顯，說明腹部推拿能改善疲勞大鼠的體力及心理狀態(tài)。另外，曠場實驗作為反映大鼠在新環(huán)境中的自主探究行為及緊張情緒的經(jīng)典實驗方法，可用來測試動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的“興奮”或“抑郁”狀態(tài)。本實驗造模后大鼠的水平及垂直活動得分明顯減少，說明造模后大鼠活動度減少，探究行為減弱，對新鮮環(huán)境的好奇程度降低，出現(xiàn)“抑郁”的情緒傾向。腹部推拿干預(yù)后，大鼠的水平及垂直活動得分明顯增加，提示腹部推拿干預(yù)后，大鼠對新環(huán)境的學(xué)習(xí)及適應(yīng)性增強。

BDNF 作為神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成和可塑性的重要調(diào)節(jié)因子[11]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其主要在神經(jīng)元胞體內(nèi)合成，由軸突末梢釋放后通過特異性受體作用于靶組織發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。此外，BDNF 也可以反向營養(yǎng)神經(jīng)元，對海馬神經(jīng)元的生長發(fā)育和保護修復(fù)起著重要作用[12]。CREB在神經(jīng)可塑性中的作用體現(xiàn)在通過蛋白激酶A的上調(diào)來調(diào)節(jié)長程抑制作用，從而調(diào)節(jié)突觸的可塑性[13]。研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)元再生比較集中的海馬顆粒細胞下層及其附近有磷酸化CREB的高水平表達，CREB能夠增強海馬顆粒細胞神經(jīng)元的整合和功能的可塑性。本實驗中，與正常對照組比較，模型對照組大鼠BDNF、CREB mRNA水平降低，腹部推拿干預(yù)后BDNF、CREB mRNA表達水平均升高。這些論述充分說明，腹部推拿可以有效緩解疲勞、改善認知，其機制可能與干預(yù)BDNF/CREB 信號途徑關(guān)鍵分子的表達與功能有關(guān)，借此途徑促進應(yīng)激損傷海馬神經(jīng)元的恢復(fù)而發(fā)揮干預(yù)CFS的作用。