生地大黃湯通過(guò)干預(yù)緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦出血模型腦水腫的改善作用?

江 珊，俞曉飛，栗春梅

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 201203)

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是臨床常見(jiàn)腦血管疾病，其高致殘率、高致死率嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生存指數(shù)，發(fā)病率占全部腦卒中的10%～15%，發(fā)病30 d死亡率接近50%，是第二大卒中類(lèi)型[1-2]。腦出血后繼發(fā)一系列病理?yè)p害，其中最主要的是各種因素誘發(fā)的腦水腫，其嚴(yán)重程度是急性腦出血預(yù)后的重要預(yù)測(cè)指標(biāo)[3-5]。Claudin-5、Occludin、Zo-1是血腦屏障結(jié)構(gòu)中主要的緊密連接蛋白，對(duì)于維持血腦屏障功能，防止腦水腫至關(guān)重要[6]。本研究旨在研究生地大黃湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦出血模型腦水腫的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)自發(fā)性雄性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)采購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(合格證號(hào)SCXK(京)2016-0006)，年齡3～4月，體質(zhì)量(300±20) g。采用動(dòng)物無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)試儀(尾套法)測(cè)量收縮壓，收縮壓達(dá)到180～200 mmHg。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水，動(dòng)物房7∶00～19∶00光照周期模擬晝夜交替，相對(duì)濕度55%，溫度22 ℃。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(倫理編號(hào)為PZSHUTCM170721001)。

1.2 主要儀器與試劑

生地大黃湯由生地黃、生大黃(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房)按3∶1比例水煎醇提濃縮制得，每毫升藥液中含2 g生藥；Occludin兔多克隆抗體(abcam,ab222691)、Claudin-5兔多克隆抗體(abcam,ab15106)、ZO-1兔多克隆抗體(abcam,ab216880)；乙醇、水合氯醛(武漢博士德生物工程有限公司)；腦立體定位儀(江灣Ⅰ型)；微量進(jìn)樣器(上海高鴿科技有限公司)；MRI設(shè)備(PHILIPS-7D978E6，Philips Medical Systems)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；手術(shù)器械、電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)等。

1.3 腦出血模型建立

采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型，具體模型建立和篩選步驟見(jiàn)前期已發(fā)表論文[7]。

1.4 分組與干預(yù)

27只SHR大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和生地大黃湯組各9只。假手術(shù)組只開(kāi)顱鉆孔進(jìn)針，后2組采用大鼠自體血注入法建立腦出血模型。造模后6 h生地大黃湯組灌胃生地大黃湯(18.5 g/kg/d)，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積純水，每天1 次，連續(xù)干預(yù)3 d。

1.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分

造模后3 h、1d、3 d各組取9只大鼠，按Longa 五級(jí)評(píng)分法[8]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分；其中0分為無(wú)神經(jīng)功能缺損，1分為動(dòng)物不能完全伸直其前肢，2分為動(dòng)物一側(cè)肢體癱瘓并有追尾現(xiàn)象，3分為動(dòng)物不能站立、打滾，4分為無(wú)自發(fā)性活動(dòng)、有意識(shí)障礙。造模后評(píng)分1～3 分認(rèn)為腦出血造模成功。

1.6 腦水腫體積MRI檢測(cè)

造模后3 d各組取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，將大鼠俯臥于大鼠線圈進(jìn)行MRI掃描，評(píng)估腦出血大鼠腦水腫情況，具體參數(shù)為T(mén)1：TR/TE=550/15，T2：TR/TE=4000/112，SL:2，F(xiàn)OV:100。根據(jù)系統(tǒng)自帶軟件勾畫(huà)計(jì)算腦水腫體積。

1.7 腦含水量測(cè)定

造模后3 d各組取3只大鼠，10%水合氯醛麻醉，生理鹽水灌流心臟后取大鼠全腦，電子天平稱(chēng)取濕重；電熱恒溫箱內(nèi)70 ℃烘烤72 h，稱(chēng)取干重。以(濕重-干重)/濕重×100%計(jì)算腦含水量，評(píng)價(jià)腦水腫程度。

1.8 Western blot檢測(cè)血腫周?chē)M織緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1

造模后3 d各組取3只大鼠取材。樣本離體后液氮速凍，-80 ℃冰箱內(nèi)保存。選取血腫周?chē)X組織，稱(chēng)重20 mg，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行勻漿、離心提取蛋白抽提液并測(cè)定濃度，電泳、轉(zhuǎn)膜、加一抗過(guò)夜，TBST清洗5 min×3次，加二抗，TBST清洗15 min×5次，顯影、曝光并掃描分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

表1顯示，造模后3 h、1d，生地大黃湯組神經(jīng)功能缺損評(píng)分與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模后3 d,生地大黃湯組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于模型組(P<0.05)。

2.2 對(duì)腦水腫的影響

表1圖1顯示，造模后3 d，模型組及生地大黃湯組大鼠可見(jiàn)血腫周?chē)X水腫形成，其中生地大黃湯組腦水腫體積明顯輕于模型組(P<0.05)。

圖1 造模后3 d MRI檢測(cè)大鼠腦水腫(T2:TR/TE=4000/112,SL:2,FOV:100)

2.3 對(duì)腦含水量的影響

表1顯示，造模后3 d，模型2組較假手術(shù)組腦含水量增加，生地大黃湯組較模型組腦含水量明顯降低(P<0.05)。

2.4 對(duì)血腫周?chē)M織緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1的影響

表1圖2顯示，造模后3 d，模型組(ICH)、生地大黃湯組(RRD)緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1表達(dá)水平較假手術(shù)組(SHAM)降低(P<0.05)，生地大黃湯組Claudin-5、Occludin、Zo-1表達(dá)高于模型組(P<0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦水腫程度、緊密連接蛋白/β-actin比較

注：與假手術(shù)組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05

圖2 Western blot檢測(cè)腦出血大鼠血腫周?chē)X組織Claudin-5、Occludin、Zo-1的含量

3 討論

腦出血后血腫周?chē)X組織水腫是主要的繼發(fā)性病理表現(xiàn)，由血腦屏障破壞引起的細(xì)胞外液體聚集導(dǎo)致血管源性水腫在腦水腫形成過(guò)程中至關(guān)重要[9]。血腦屏障由內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞和基質(zhì)構(gòu)成，其中內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接蛋白相連[10]。Claudin-5、Occludin、Zo-1是緊密連接蛋白的主要成分，敲除Claudin-5基因小鼠的血腦屏障通透性增加，降低Occludin、Zo-1表達(dá)同樣加大了血腦屏障的滲透性[6]。

中醫(yī)藥治療急性出血性中風(fēng)歷史悠久，并積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。近年中醫(yī)藥因其多靶點(diǎn)、多途徑治療特點(diǎn)而備受關(guān)注。生地大黃湯為治療血證的著名古方，首見(jiàn)于唐·孫思邈《千金翼方》，藥用生地黃、生大黃。生大黃是治療急性腦出血的常用藥物[11]，其瀉熱毒、破積滯、行瘀血可改善血液循環(huán)，降低顱內(nèi)壓，減輕腦水腫。單味中藥生地注射液對(duì)腦出血大鼠具有促神經(jīng)修復(fù)及抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡作用[12]。生地黃甘寒滋陰止血，生大黃苦寒清熱活血，由生地黃和生大黃組成的古方生地大黃湯，用于治療急性出血性中風(fēng)，共奏清熱滋陰、止血活血之功用。

本研究旨在探討生地大黃湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦出血模型腦水腫的影響及其可能機(jī)制。結(jié)果顯示，大鼠腦出血模型造模后神經(jīng)功能缺損明顯，加用生地大黃湯3 d，生地大黃湯組神經(jīng)功能缺損顯著改善；大鼠腦出血模型造模后腦水腫體積、腦含水量明顯上升，加用生地大黃湯3 d，生地大黃湯組腦水腫體積減小，腦含水量明顯減輕。大鼠腦出血模型造模后血腫周?chē)X組織Claudin-5、Occludin、Zo-1表達(dá)下降，加用生地大黃湯3 d，生地大黃湯組Claudin-5、Occludin、Zo-1蛋白水平表達(dá)上升。表明生地大黃湯對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦出血模型腦水腫程度有明顯的改善作用，能減少腦水腫體積，降低腦組織含水量，緩解神經(jīng)功能缺損，而其可能的機(jī)制與生地大黃湯干預(yù)緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin、Zo-1相關(guān)。