補(bǔ)中益氣湯對(duì)急性腦缺血大鼠行為學(xué)及腦損傷的影響?

王 丹，毛 媛，刑曉娟

(慶陽(yáng)市人民醫(yī)院，甘肅 慶陽(yáng) 745000)

作者簡(jiǎn)介：王 丹(1987-)，女,甘肅慶陽(yáng)人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事神經(jīng)內(nèi)科的臨床與研究。

急性腦缺血是常見的腦血管急癥，主要由于頸動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊形成阻塞血管腔所致。急性腦缺血可導(dǎo)致局部組織缺血缺氧性損傷，引發(fā)神經(jīng)功能缺損和認(rèn)知障礙。我國(guó)腦梗塞的發(fā)病率高，且超過(guò)50%的患者可出現(xiàn)缺血缺氧性認(rèn)知功能障礙[1]，因此對(duì)急性腦缺血后行為和認(rèn)知功能采取有效措施進(jìn)行改善至關(guān)重要。常規(guī)西醫(yī)康復(fù)治療對(duì)此類患者認(rèn)知功能、神經(jīng)功能和日常生活能力均有改善作用，但是仍有提升空間[2]。近年來(lái)，中醫(yī)藥在改善急性腦缺血后認(rèn)知功能障礙患者認(rèn)知功能方面的作用逐漸得到認(rèn)可。補(bǔ)中益氣湯可補(bǔ)中益氣、養(yǎng)陰生津[3]，在腦梗塞恢復(fù)期效果確切[4]，但是關(guān)于其對(duì)急性腦缺血的作用及機(jī)制仍需探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

50只SPF級(jí)SD成年雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(豫)2017-015)。

1.2 藥物

補(bǔ)中益氣湯方組成：黃芪15 g，人參15 g，白術(shù)10 g，炙甘草15 g，當(dāng)歸10 g，陳皮6 g，升麻6 g，柴胡12 g，生姜9片，大棗6枚，中藥材均購(gòu)自天津藥材公司，采用水提醇沉淀法提取藥液，每1 ml藥液相當(dāng)于1 g生藥。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材

Morris水迷宮及其配套圖像采集分析系統(tǒng)(寶生物(大連)科技有限公司)，SM2010R徠卡切片機(jī)(徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司)，電泳儀、CheniDoc XRS化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)； CX41-12C02型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

黑色染料(上海滬江鈦白化工制品有限公司，批號(hào)20170506 A)；BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo公司，批號(hào)20170903)；B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Caspase-3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Bax)兔抗鼠單克隆抗體(一抗)、Bcl-2、Caspase-3、Bax?？雇脝慰寺】贵w(二抗)(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)E2506、E2413、E2686、E2907、E2915、E2928)。

1.5 分組、造模及干預(yù)

將大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組及低、中、高劑量組各10只。建模方法：10%的水合氯醛腹腔麻醉，劑量為350 mg/kg，仰位固定并做頸正中切口，對(duì)右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈鈍性分離迷走神經(jīng)。由頸總動(dòng)脈分叉處向頭端游離，結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈近心端、頸外動(dòng)脈及其分支動(dòng)脈，游離主干。分離右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈，沿其向下分離翼腭動(dòng)脈，結(jié)扎根部，僅保留頸內(nèi)動(dòng)脈入顴骨主干。在頸外動(dòng)脈近端備線，暫時(shí)夾閉其遠(yuǎn)端，由頸總動(dòng)脈分叉處做切口并插入尼龍線(4～0)，推進(jìn)并通過(guò)大腦中動(dòng)脈起始處，阻斷大腦中動(dòng)脈部分血流并縫合皮膚。對(duì)側(cè)操作方法同上。注意將大鼠體溫維持在37.0～37.5 ℃。模型對(duì)照組和3劑量組均按照上述方法造模，假手術(shù)組除不插線外，其余操作均同上。術(shù)后2 h 低、中、高劑量組分別給予補(bǔ)中益氣湯灌胃，參照文獻(xiàn)[5]中大鼠臨床等效劑量計(jì)算方法得出用藥劑量，低劑量組0.5 g/kg，中劑量組1.0 g/kg，高劑量組1.5 g/kg，假手術(shù)組和模型對(duì)照組均給予2 ml生理鹽水灌胃，每天1次，持續(xù)2周。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 行為學(xué)評(píng)價(jià)[6]BBB運(yùn)動(dòng)功能：持續(xù)干預(yù)2周后采用BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分評(píng)價(jià)，共分各關(guān)節(jié)活動(dòng)能力(0～7分)、后肢步態(tài)及協(xié)調(diào)能力(0～5分)、運(yùn)動(dòng)過(guò)程中爪的精細(xì)動(dòng)作(0～9分)3部分共21分，評(píng)分越高說(shuō)明運(yùn)動(dòng)功能越理想。

Rivlin-Tator斜板試驗(yàn)：持續(xù)干預(yù)2周后采用Rivlin-Tator斜板試驗(yàn)評(píng)價(jià)，將大鼠放置在紋理厚度為1 mm的橡皮斜板上，使其身體長(zhǎng)軸與斜板縱軸垂直，每次抬高斜板5°，以大鼠能停留5 s的最大角度即為功能值。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：持續(xù)干預(yù)2周后采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)制作水迷宮，宮體直徑150 cm，高60 cm，將水池等分為4個(gè)象限，并在宮壁標(biāo)明4個(gè)對(duì)應(yīng)入水點(diǎn)；安全島位于第一象限，平臺(tái)直徑約為8 cm，大約高出水平面1 cm，內(nèi)盛有溫水，平臺(tái)上放置少量飼料，水中摻入適量黑色染料。在水迷宮上安裝攝像頭記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，共包括定位航行訓(xùn)練和空間探索試驗(yàn)。定位航行訓(xùn)練：第1～5天進(jìn)行定位航行訓(xùn)練，每天訓(xùn)練4次，間隔時(shí)間為2 h，隨機(jī)選擇入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁輕放入水中。記錄小鼠60 s內(nèi)找到并登上安全島的時(shí)間，為逃避潛伏期，若大鼠未能找到安全島，則需要實(shí)驗(yàn)者對(duì)其進(jìn)行引導(dǎo)使其停留30 s，將逃避潛伏期記錄為60 s，將大鼠取出并擦干后放入飼養(yǎng)籠中；空間探索試驗(yàn)：第6天將安全島撤除，隨機(jī)選擇入水點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄其60 s內(nèi)的運(yùn)動(dòng)軌跡，統(tǒng)計(jì)目標(biāo)象限內(nèi)停留時(shí)間占比和目標(biāo)象限內(nèi)游泳距離占比。

1.6.2 腦指數(shù)測(cè)定 持續(xù)干預(yù)2周且完成上次檢測(cè)后采用電子天平對(duì)大鼠的體質(zhì)量進(jìn)行稱量，隨即處死后立即取完整腦組織，稱重后將其放置在冰盤上，腦指數(shù)=腦濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100.00%。

1.6.3 海馬區(qū)組織病理學(xué)觀察變化 沿著端腦顳葉的內(nèi)側(cè)深部切取海馬區(qū)腦組織塊，10%福爾馬林浸泡48 h，脫水、透明和石蠟包埋后進(jìn)行HE染色，中性樹膠封片在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6.4 海馬區(qū)組織凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 取海馬區(qū)組織，采用蛋白免疫印跡法(WB)對(duì)Caspase-3、Bcl-2、Bax進(jìn)行檢測(cè)。按蛋白提取試劑盒步驟提取總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)。每孔上樣量為20 μg，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)120 min轉(zhuǎn)膜。脫脂奶粉搖床封閉2 h，加入一抗(1∶1000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜，加入二抗(1∶10000)，常溫孵育2 h，暗室中曝光、顯影及定影。應(yīng)用凝膠成像軟件掃描拍照，使用BandScan灰度值分析軟件分析，以Caspase-3、Bcl-2、Bax灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比值為蛋白表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)中益氣湯對(duì)急性腦缺血大鼠行為學(xué)和腦指數(shù)的作用

表1顯示，假手術(shù)組干預(yù)期間無(wú)死亡，模型對(duì)照組與低、中、高劑量組干預(yù)期間分別有3只、2只、3只、3只大鼠死亡，因而假手術(shù)組、模型對(duì)照組、低、中、高劑量組樣本量分別為10、7、8、7、7。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組BBB評(píng)分、Rivlin-Tator斜板試驗(yàn)結(jié)果均顯著降低(P<0.05)，3劑量組治療后均有顯著改善，其中高劑量組效果最為顯著(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，而目標(biāo)象限內(nèi)停留時(shí)間占比、目標(biāo)象限內(nèi)游泳距離占比降低(P<0.05)，腦指數(shù)顯著增加(P<0.05)。經(jīng)過(guò)藥物治療均有顯著改善，其中高劑量組改善效果最為顯著(P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學(xué)和腦指數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較：aP<0.05；與模型對(duì)照組比較：bP<0.05；與低劑量組比較：cP<0.05；與中劑量組比較：dP<0.05

2.2 各組大鼠治療前后海馬腦區(qū)的病理染色結(jié)果

圖1顯示，假手術(shù)組可見神經(jīng)元排列緊密、整齊，胞體飽滿，結(jié)構(gòu)清晰，分布均勻，數(shù)量無(wú)減少，無(wú)異常形態(tài)學(xué)改變，椎體細(xì)胞層排列緊致、規(guī)則，細(xì)胞輪廓清晰(圖1 A)；模型組可見神經(jīng)元嚴(yán)重排列稀松，神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)不完整，有嚴(yán)重胞核溶解、細(xì)胞破裂現(xiàn)象，細(xì)胞周圍高度水腫(圖1B)；高劑量組可見神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，分布相對(duì)均勻，數(shù)量少有減少，椎體細(xì)胞層排列相對(duì)規(guī)則，細(xì)胞輪廓清(圖1C)，與假手術(shù)組相近；中劑量組可見神經(jīng)元有所改變，分布不均，數(shù)量減少，有部分胞核溶解、細(xì)胞破裂現(xiàn)象，椎體細(xì)胞層排列不規(guī)則，輪廓不清(圖1D)；低劑量組可見神經(jīng)元排列稀松，神經(jīng)阻滯結(jié)構(gòu)不完整，胞核溶解、細(xì)胞破裂明顯，效果最差(圖1E)。

圖1 各組大鼠海馬區(qū)病理染色結(jié)果比較(HE染色 ×200)

2.3 補(bǔ)中益氣湯對(duì)急性腦缺血大鼠海馬區(qū)腦組織凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的作用

圖2 各組Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

圖2表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。經(jīng)過(guò)治療后3劑量組Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量均有所降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)量均有所升高(P<0.05)，其中高劑量組效果最為顯著(P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬區(qū)組織凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：與假手術(shù)組比較：aP<0.05；與模型對(duì)照組比較：bP<0.05；與低劑量組比較：cP<0.05；與中劑量組比較：dP<0.05

3 討論

急性腦缺血發(fā)生后，由于血液和氧氣供應(yīng)不足，顱內(nèi)神經(jīng)可出現(xiàn)過(guò)氧化應(yīng)激損傷，過(guò)多的氧自由基難以及時(shí)被清除，且可產(chǎn)生大量促炎癥因子，各種病理學(xué)變化相互作用，共同誘發(fā)神經(jīng)損傷[7]，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙。而損傷的神經(jīng)支配肢體功能將會(huì)出現(xiàn)明顯的障礙，因此保護(hù)認(rèn)知功能有助于改善腦缺血導(dǎo)致的認(rèn)知與行為障礙。但目前臨床仍缺乏有效的急性腦缺血后認(rèn)知功能障礙患者行為學(xué)和認(rèn)知功能的改善措施。

本次研究中發(fā)現(xiàn)，高劑量組行為學(xué)顯著改善，且明顯優(yōu)于中劑量組和低劑量組，可知補(bǔ)中益氣湯能夠有效改善缺血缺氧性認(rèn)知功能障礙大鼠的行為學(xué)，且高劑量組的效果最佳。此外，HE染色觀察結(jié)果顯示，正常組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)、狀態(tài)均正常，而高劑量組與正常對(duì)照組最為接近，提示補(bǔ)中益氣湯對(duì)急性腦缺血大鼠認(rèn)知功能的保護(hù)作用顯著，且呈劑量依賴性。中醫(yī)認(rèn)為[8]，急性腦缺血屬于中醫(yī)學(xué)“卒中”范疇，根本病因在于氣陰兩虛、血瘀氣滯、肝火上亢、風(fēng)痰阻絡(luò)等。補(bǔ)中益氣湯圍繞虛瘀下藥，方中黃芪為君藥，補(bǔ)中益氣、固表升陽(yáng)，臣以人參、炙甘草、白術(shù)健脾益氣；當(dāng)歸養(yǎng)血和營(yíng)，陳皮理氣和胃，可使諸藥補(bǔ)而不滯；升麻、柴胡升陽(yáng)舉陷，以升提下陷之中氣；生姜可增強(qiáng)食欲、活血驅(qū)寒；大棗可補(bǔ)血益氣，共為使藥，諸藥合用共達(dá)補(bǔ)中益氣、養(yǎng)陰生津、養(yǎng)血和營(yíng)之功效[9]。補(bǔ)中益氣湯重用黃芪，以補(bǔ)中益氣、升陽(yáng)固表，且以升麻、柴胡協(xié)黃芪、人參升陽(yáng)舉陷、補(bǔ)氣養(yǎng)血，使甘溫之氣充填內(nèi)外，元?dú)鈨?nèi)充，故而該方劑可使氣陷者升之，氣虛者補(bǔ)之，清陽(yáng)得升，元?dú)獾贸?，病恙得除，諸癥自消。本研究中行為學(xué)和HE染色均發(fā)現(xiàn)，3劑量組結(jié)果顯著改善，可知補(bǔ)中益氣湯中諸多成分能夠協(xié)同作用，對(duì)急性腦缺血大鼠發(fā)揮改善行為學(xué)和腦保護(hù)的作用，推測(cè)在臨床中具有可行性，但仍需臨床試驗(yàn)證實(shí)。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)[10-11]，黃芪、人參等補(bǔ)氣中藥能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗缺氧能力，改善缺氧狀態(tài)，減輕氧化應(yīng)激損傷和神經(jīng)功能缺損程度，改善行為學(xué)。

本研究還顯示，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組海馬區(qū)組織Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低，可知在急性腦缺血大鼠中海馬區(qū)組織Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)異常升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)異常降低。經(jīng)過(guò)治療后3劑量組Caspase-3、Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降，Bcl-2蛋白表達(dá)量均升高，其中高劑量組效果最佳，可知補(bǔ)中益氣湯在急性腦缺血大鼠中應(yīng)用能夠下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。大鼠海馬區(qū)組織主要發(fā)揮記憶和空間定位作用，在急性腦缺血所致的腦損傷發(fā)生過(guò)程中出現(xiàn)海馬區(qū)損傷，損傷其神經(jīng)功能進(jìn)而導(dǎo)致行為障礙。故本次研究選取海馬區(qū)組織作為對(duì)象檢測(cè)相關(guān)蛋白，探討補(bǔ)中益氣湯的作用機(jī)制。Bcl-2可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自身基因，啟動(dòng)死亡效應(yīng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和認(rèn)知功能損傷中發(fā)揮作用[12-13]；而Caspase-3是與Bcl-2相關(guān)的一類蛋白，且與Bcl-2高度同源，當(dāng)Caspase-3同源二聚體含量升高，可加快神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，加重認(rèn)知功能損傷；Bax具有重要的調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用，正常情況下表達(dá)量低，一旦被激活，可通過(guò)細(xì)胞表面死亡受體途徑或線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡[14-15]。本研究中發(fā)現(xiàn)，采用補(bǔ)中益氣湯能夠調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白，發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。推測(cè)補(bǔ)中益氣湯能夠通過(guò)下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善急性腦缺血大鼠的行為學(xué)，發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上，補(bǔ)中益氣湯能改善急性腦缺血大鼠的行為學(xué)，發(fā)揮腦保護(hù)作用，推測(cè)與下調(diào)Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)，但在急性腦缺血患者中的作用機(jī)制仍需深入探討。