豬德爾塔病毒H223 株的分離鑒定和持續(xù)傳代及N 基因遺傳進化分析

賀東生，李錦輝，蘇丹萍，司廣斌，李 根

（華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東 廣州 510642）

豬德爾塔病毒，又名豬丁型冠 狀 病 毒、δ 冠 狀 病 毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)， 是近年來新出現(xiàn)的一種豬腸道冠狀病毒。豬丁型冠狀病毒屬于套式病 毒 目(Nidovirales)、 冠 狀 病 毒科(Coronaviridae)、 冠 狀 病 毒 屬(Coronaviras) 的新成員，為不分節(jié)段的單股正鏈RNA 病毒，基因組全長約25.4 kb，基因組結構為5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-NNS7-3' UTR[1,2]。

豬丁型冠狀病毒引起的臨床癥狀與豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉相似[3,4]，很難通過臨床等手段鑒別診斷[5]。發(fā)病豬主要表現(xiàn)為嘔吐、腹瀉、脫水、嗜睡等特征[6]。PDCoV 發(fā)病后會因年齡差異而有不同的癥狀[7]，新生仔豬往往表現(xiàn)為嚴重腹瀉，且由于大量脫水而死亡迅速[8]，成年豬則不甚相同，無癥狀或癥狀較輕[9]，不易死亡，母豬感染PDCoV 的臨床癥狀為腹瀉和厭食。

PDCoV 的病變主要集中在在小腸和胃[10]。發(fā)病仔豬剖檢可見小腸腸管擴張，腸壁透亮明顯可見腸內水樣內容物，并且含有泡沫或是未消化的凝乳塊，尤其是空腸和回腸發(fā)生嚴重性的萎縮性腸炎，腸系膜明顯可見出血的淋巴結和擴張的血管。顯微鏡下可以觀察到炎性細胞浸潤，腸黏膜絨毛嚴重萎縮。胃部出現(xiàn)明顯膨脹，胃底膜內有輕度出血發(fā)紅的現(xiàn)象[11]。

豬丁型冠狀病毒最早在2012 年被香港學者報道出來，2014 年在美國俄亥俄州大范圍暴發(fā)，之后很快傳播到美國的其他地區(qū)。目前為止，美國、加拿大、韓國、中國大陸、泰國和老撾等國家均已經檢測和報道了PDCoV[2,12-14]。如今該病毒已經給世界上的養(yǎng)豬大國造成了嚴重的經濟損失。

我們在2015 年率先報道了本病在規(guī)模豬場暴發(fā)，但未能成功分離到病毒[5]。本研究從江西某疑似病毒性腹瀉豬場的發(fā)病仔豬小腸內容物中獲取病料，通過在ST 細胞系上連續(xù)盲傳，成功分離到豬丁型冠狀病毒，并對該分離株的N 基因進行遺傳進化分析，報道如下。

1 材料與方法

1.1 病毒及細胞系

病料來源于江西省某病毒性腹瀉豬場哺乳仔豬小腸內容物，ST 傳代細胞系由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院傳染病教研室保存。

1.2 試劑與儀器

胰 蛋 白 酶、DMEM 營 養(yǎng)液、 胎 牛 血 清 購 自Gibco 公司；One step RT-PCR 試 劑 盒、DNA Marker-1000 購自Takara 公司；細胞培養(yǎng)箱購自賽默飛公司，倒置顯微鏡(尼康)。

1.3 引物的設計及合成

根 據Genbank 中 登 錄 的PDCoV 參考毒株全基因序列，利用Primers 5.0 軟件合成1 對針對N 基因的特異性引物，引物序列引物由華大生物技術有限公司合成。

1.4 病毒RNA 的提取

將小腸內容物與PBS 以1：3的比例稀釋，充分震蕩后反復凍融3 次，6 000 r/min 離心10 min，按試劑盒說明書提取上清液中，將病毒總RNA 置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒的PCR 檢測

以病毒總RNA 為模板進行PCR 擴增，反應體系為:Onestep RT-PCR buffer 10 μL，上下游引物 各0.5 μL , RNA 模 板3 μL， 滅菌 的DEPC 水5.6 UL。PCR 擴 增程序為:50 ℃ 30 min；94 ℃預變性5 min；95 ℃變性1 min；53 ℃復性30 S；72 ℃延伸1 min，45 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR 擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢側，用凝膠成像系統(tǒng)對電泳結果進行分析。

1.6 病毒的分離

取PCR 檢測結果呈陽性的病料樣品，在12 000 g 下離心8 min，取上清液用0.22 μm 無菌過濾器過濾除菌，以獲得接種細胞的無菌病毒液。將ST細胞鋪滿整個6孔細胞培養(yǎng)板，待單層細胞融合至90%～95%時棄去培養(yǎng)液，用PBS 清洗3 遍，將處理好的病毒液以600 μL/孔接種5孔，另1 孔接種DMEM 培養(yǎng)液作為陰性對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育1 h 后取出培養(yǎng)板，棄去液體，每孔中加入2 mL 的含有胰酶的維持液，然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 d，收獲病毒培養(yǎng)物，反復凍融3 次，繼續(xù)進行下一代盲傳，直至出現(xiàn)穩(wěn)定的CPE。

1.7 N 基因的克隆測序

將陽性PCR 產物經純化回收后與PMD-19T 載體連接，轉化到DH5a 感受態(tài)細胞中，培養(yǎng)后挑單個菌落進行PCR 鑒定，鑒定成功的重組質粒送往華大基因生物技術有限公司進行測序。

1.8 N 基因的遺傳進化分析

根據GeneBank 上已公布的10株PDCoV 參考毒株(表1)，利用DNA Star 和MEGA7 軟件對N 基因的測序結果進行處理和遺傳進化分析，并繪制遺傳進化樹。

2 結果與分析

2.1 病料PCR 檢測結果

以 提 取 的RNA 為 模 板， 用PDCoV 的N 基因引物對樣品進行檢側。結果所示(見圖1),PDCoV 在1 248 bp 左右有明顯條帶，檢側結果為陽性。由此說明該病毒為PDCoV。將PDCoV PCR 產物純化后構建至pMD-19T 質粒并進行測序，成功克隆了該病毒的目標序列，并獲得N基因序列，序列長度為1 248 bp。

表1 GeneBank 已登錄的PDCoV 參考毒株

2.2 PDCoV H223 株的分離

病毒接種單層ST 細胞盲傳后，在20 h 時后開始出現(xiàn)病變，細胞變圓、細胞核濃縮、病變細胞呈拉絲細狀態(tài)并大量死亡，死亡細胞懸浮于培養(yǎng)液中（圖2A），對照組細胞生長良好(圖2B)。36 h 后，細胞的CPE 達80%以上，對照組仍存在致密的單層細胞，只有少量的細胞漂浮在液面。該病毒在ST 細胞系上能夠穩(wěn)定增殖。

在感染ST 細胞后72 h 收毒，每代次的病毒收獲物均進行PCR 檢測結果均為陽性。隨著傳代次數(shù)的增加，出現(xiàn)CPE 的時間縮短且程度隨之加劇。病毒傳代每隔5 代都進行N 基因核苷酸測序，已確保分離的是PDCoV，目前已傳至第65 代，確定成功分離了一株豬丁型冠狀病毒，命名為PDCoV H223 株。

圖1 PDCoV H223 株的N 基因PCR 擴增結果圖

2.3 PDCoV H223 株N 基因的同源性分析

圖2 PDCoV H223 株接種ST 細胞的細胞病變圖

圖3 PDCoV H223 株N 基因的序列同源性分析

圖4 PDCoV 223 毒株N 基因的遺傳進化樹

以GenBank 中已發(fā)表的10株PDCoV 毒株為參考(表1)，用DNA Star 軟件進行PDCoV N 基因序列同源性分析(圖3)。結果顯示，H223 株N 基因序列與已公布的10株PDCoV N 基因序列的同源性為97.2%～99.3%，與中國廣東毒株的同源性最高，與越南毒株的同源性最低。

2.4 PDCoV H223 株N 基因的遺傳進化分析

以表1 中的10 株PDCoV 參考毒株為參考，運用MEGA7.0 軟件采用Neigh-bor-Joining 聚類分析方法構建基于N 基因序列的遺傳進化樹(圖4)。結果顯示，H223 毒株與廣東毒株PDCoVCHGD2016 毒株處于同一分支，與越南、美國等其他國家的親緣關系較遠。本次鑒定毒株為豬丁型冠狀病毒病毒(PDCoV)，命名為H223。

3 討論

豬丁型冠狀病毒自2014 年美國首次在俄亥俄州被檢測到并且成功分離到此病毒以來，該病毒的暴發(fā)和流行呈現(xiàn)全球性趨勢[2]。近年來我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展較快，但總體水平不高，據調查，腹瀉引起的仔豬死亡數(shù)占仔豬總死亡數(shù)的半數(shù)以上，其中引發(fā)仔豬高發(fā)病率、高死亡率的主要的病原是豬腹瀉病毒。豬腹瀉病毒主要有3 種，TGEV、PEDV和PDCoV，近幾年主要的病原為PEDV 和PDCoV， 其 中PEDV 在臨床上有滅活疫苗或部分活疫苗用于防治，而PDCoV 由于發(fā)現(xiàn)較晚，病毒分離非常困難，對其研究難以深入，目前尚無有效的防控措施，且由于感染PDCoV 的動物臨床癥狀與感染PEDV,TGEV 的動物臨床癥狀相似，PDCoV 常與PDEV 等發(fā)生混合感染，導致確診困難，使得PDCoV 成為現(xiàn)在影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的一大難題。

豬丁型冠狀病毒嚴重影響著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，迫切需要進一步加強其生物學特性以及致病性研究，提供防控預案，緩解由豬丁型冠狀病毒給養(yǎng)豬產業(yè)帶來的的經濟損失。本研究成功分離了一株豬丁型冠狀病毒，并命名為H223，對該分離株高和低代次的N 基因進行了測序和遺傳進化分析，分析結果表明該病毒的遺傳穩(wěn)定性很高。該病毒目前已傳至第65 代,且能出現(xiàn)穩(wěn)定的病變,有較高的病毒滴度，有望對新疫苗的研制提供幫助。