健陰栓微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)及體外抑菌作用研究

張明君，哈麗旦·蘇萊曼，李海芳

(新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所藥理與微生物檢驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830004)

中成藥健陰栓主要由沒食子、石榴花、枯礬、兒茶和石榴皮等5種藥材組成，按照維吾爾醫(yī)學(xué)理論，該藥具有清除異常黏液質(zhì)、消炎、收斂、燥濕和清熱解毒的功效，臨床擬用于治療女性宮頸炎、濕性白帶增多、宮頸肥大、滴蟲陰道炎及細(xì)菌性陰道病等病癥。中藥栓劑是以中藥飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代化工藝提取而成，與適合的基質(zhì)混合而成，專供腔道用藥的固體制劑，具有攜帶方便、質(zhì)量穩(wěn)定、安全有效和藥效持久等特點(diǎn)[1]。為了加強(qiáng)對健陰栓的質(zhì)量控制，本研究進(jìn)行了該藥的微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)及體外抑菌作用研究，為其臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)，EL500S型電子天平(常州市天之平設(shè)備有限公司)，WDP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海安亭科學(xué)儀器有限公司)，QS-PY150型智能生化培養(yǎng)箱(上海奇珊電子科技有限公司)，一次性接菌環(huán)、一次性L涂布棒(BIOLGIX公司)等。

1.2 藥品與試劑

健陰栓(新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，規(guī)格：3 g/個，批號：170960、170961及170962)。pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：20160723)、胰酪大豆胨液體(批號：20170504)、胰酪大豆胨瓊脂(批號：20170623)、沙氏葡萄糖液體(批號：20160921)、沙氏葡萄糖瓊脂(批號：20170523)、甘露醇氯化鈉瓊脂(批號：20150804)、溴化十六烷基三甲胺瓊脂(批號：20151216)、梭菌增菌培養(yǎng)基(批號：20170215)、哥倫比亞瓊脂(批號：20161103)、念珠菌顯色培養(yǎng)基(批號：20160723)及硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基(批號：20160817)均購于青島高科園海博科技有限公司；0.9%氯化鈉溶液(自配)；上述培養(yǎng)基與試劑均經(jīng)過121 ℃高壓滅菌后，冷卻至45 ℃左右備用。

1.3 菌株

大腸埃希菌[菌號：CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[菌號：CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[菌號：CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌[菌號：CMCC(B)10104]、生孢梭菌[菌號：CMCC(B)64941]、白色念珠菌[菌號：CMCC(F)98001]和黑曲霉[菌號：CMCC(F)98003]，均購于中國食品藥品檢定研究院，菌株均為第3代。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌株活化及菌液制備

將凍存于-80 ℃冰箱中的菌株取出，放至室溫(25 ℃)下融化，將大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及銅綠假單胞菌均各取1環(huán)，接于胰酪大豆胨液體中，放入33 ℃培養(yǎng)20 h；生孢梭菌接于硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，放入33 ℃培養(yǎng)箱中20 h；白色念珠菌取1環(huán)接于沙氏葡萄糖液體中，放入23 ℃培養(yǎng)箱20 h。取出活化好的菌株，用0.9%氯化鈉溶液制成含菌數(shù)<100 cfu/ml的菌懸液，備用。取經(jīng)25 ℃培養(yǎng)5 d的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，制成含孢子數(shù)<100 cfu/ml的孢子懸液備用。

2.2 微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)

2.2.1 供試液的制備：取樣品10 g，加入至含2%吐溫80的pH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 ml中，得到1∶10供試液備用。

2.2.2 需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)：(1)平皿法。取1∶10的供試液10 ml，加入制備好的菌液0.1 ml，混合均勻。取含菌的供試液1 ml置于平皿中，注入相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基，置規(guī)定溫度中培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。(2)薄膜過濾法。取1∶10的供試液10 ml過濾，用pH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液500 ml分5次沖濾膜，在最終1次沖洗液中加入≤100 cfu/ml的菌株1 ml過濾，取出濾膜，菌面朝上，貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上，至規(guī)定溫度中培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果。

2.2.3 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)：(1)金黃色葡萄球菌。取1∶10的供試液10 ml，用薄膜過濾法沖洗500 ml/膜，再接種至100 ml胰酪大豆胨液體中，33 ℃培養(yǎng)18 h，取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)18 h。(2)銅綠假單胞菌。取1∶10的供試液10 ml，接種至100 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)18 h，取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)18 h。(3)梭菌。取1∶10的供試液10 ml，接種至100 ml梭菌增菌培養(yǎng)基中，33 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，再劃線接種于哥倫比亞瓊脂平板上，33 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。(4)白色念珠菌。取1∶10的供試液10 ml，加至100 ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，33 ℃培養(yǎng)3 d，劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)24 h，挑取菌落至念珠菌顯色培養(yǎng)基上，33 ℃培養(yǎng)24 h，符合《中華人民共和國藥典：四部》(2015年版)的要求。

2.2.4 結(jié)果：測定健陰栓的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)的回收比，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)(見表1—2)，回收比均在0.5～2之內(nèi)。表明健陰栓需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)可采用1∶10的供試液按照平皿法測定，霉菌及酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)可采用薄膜過濾法沖洗液500 ml/膜測定；控制菌檢查均可采用常規(guī)法。

表1 健陰栓微生物限度檢查法需氧菌總數(shù)回收比(1∶10供試液)Tab 1 Recovery ratio of aerobic bacteria count in the microbial limit test (1∶10 test solution) of Jianyin suppository

表2 健陰栓微生物限度檢查法霉菌及酵母菌總數(shù)回收比(1∶10供試液)Tab 2 Recovery ratio of mold and yeast count in the microbial limit test (1∶10 test solution) of Jianyin suppository

2.3 體外抑菌作用

2.3.1 供試液的制備：取樣品20 g，加入至pH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液20 ml中，充分溶解并混勻，得到供試液(1 g/ml)備用。

2.3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定：采用試管二倍稀釋法[2]分別測定樣品對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的MIC。即在無菌條件下，取小試管11支，按照1—11編號，排列于試管架上；2—10號的試管分別加入胰酪大豆胨液體或沙氏葡萄糖液體1 ml，取制備好的供試液2 ml，加至1號試管中混勻，從1號試管中吸取1 ml放入2號試管中，同樣混勻后吸出1 ml放入3號的試管；同法進(jìn)行，稀釋至8號的試管。從8號試管中，取出1 ml于11號的空試管中作為空白對照；第10號的試管中，加胰酪大豆胨液體或沙氏葡萄糖液體0.5 ml與pH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液0.5 ml作為稀釋劑對照；第9號的試管不加供試液，作為陽性對照。在第1—10號的試管中，分別加入含菌數(shù)為103～105CFU/ml菌懸液0.1 ml，連同第11號的試管一同放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。再從每個試管中，各取1接菌環(huán)，劃線接種于胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂平板上，放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h。觀察瓊脂平板上菌落的生長情況。在劃有陽性對照與稀釋劑對照的瓊脂平板上的菌落應(yīng)生長良好；而空白對照管的瓊脂平板上無菌落生長的前提下，觀察劃有第1—8號的試管瓊脂平板上菌落生長的情況，以無菌落生長的最低供試液濃度為該樣品的MIC[3-4]。

2.3.3 最低殺菌濃度(MBC)的測定：于健陰栓供試液有效抑菌濃度的試管(即有菌生長的試管)中，供試液與對照組對應(yīng)的試管培養(yǎng)基中，分別取溶液0.1 ml，涂布至相應(yīng)胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂平板上，用L涂布棒均勻輕推供試液，再將平板培養(yǎng)24 h。觀察瓊脂平板上有無菌落生長，以平板上計(jì)數(shù)<5個的菌落供試液濃度作為該樣品的MBC[5]。

2.3.4 結(jié)果：健陰栓供試液0.007 8～1.000 0 g/ml對大腸埃希菌和白色念珠菌均無抑菌作用，劃線平板上均有菌落生長。而該供試液對其余3種菌株均顯示出不同程度的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌的MIC為0.25 g/ml，MBC為0.5 g/ml；對銅綠假單胞菌的MIC和MBC均為0.25 g/ml；對枯草芽孢桿菌的MIC和MBC均為0.25 g/ml，見表3—4。

表3 健陰栓體外抑菌作用結(jié)果Tab 3 Results of bacteriostasis in vitro of Jianyin suppository

注: “+”表示有菌落生長，“-”表示無菌落生長，“①”表示MIC；“②”表示MBC

Note: “+” means colony growth, “-” means no colony growth, “①”indicates MIC; “②”indicates MBC

表4 健陰栓對各菌株的MIC和MBC(g/ml)Tab 4 MIC and MBC values of Jianyin suppository against each strain (g/ml)

3 討論

參考相關(guān)研究結(jié)果，本研究進(jìn)行了健陰栓微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)，并初步測定了體外抑菌作用的相關(guān)數(shù)據(jù)，以確保該藥在臨床應(yīng)用上更加準(zhǔn)確、有效[6-7]。本研究結(jié)果顯示，健陰栓對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌均有抑制作用，對大腸埃希菌和白色念珠菌無抑制作用，且其對銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用優(yōu)于金黃色葡萄球菌。

體外抑菌作用試驗(yàn)方法包括試管二倍稀釋法、平板打孔法及紙片擴(kuò)散法等。本研究采用試管二倍稀釋法及瓊脂平板法結(jié)合，更為準(zhǔn)確可靠。中成藥大多含有多種中藥材，成分較為復(fù)雜，其供試液的顏色一般較深且渾濁，影響試驗(yàn)結(jié)果觀察，無法準(zhǔn)確判斷試管中有無菌落生長[8-9]；在藥品的處理方法中，有機(jī)溶劑的使用可能會影響藥品的真實(shí)抑菌作用，因此，本研究聯(lián)合2種方法進(jìn)行體外抑菌作用試驗(yàn)，可有效避免藥物成分被破壞，保證健陰栓抑菌作用結(jié)果的準(zhǔn)確性。微生物的污染監(jiān)控是藥品質(zhì)量與安全的重要指標(biāo)[10-12]，應(yīng)建立準(zhǔn)確可靠的微生物限度檢查方法，有效地消除其抑菌的成分[10]。

引起宮頸炎、陰道炎的病原體除了淋球菌、支原體、衣原體、滴蟲和念珠菌等外，還有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及白色念珠菌等病原微生物[13]。健陰栓擬用于細(xì)菌性陰道病等病癥。本研究結(jié)果表明，健陰栓對以上部分病原微生物的生長均有一定的抑制作用，說明其具有良好的抑菌及殺菌作用，但具體作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。