果糖誘導(dǎo)斑馬魚肝臟脂肪變性的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

陳博，張靖溥

果糖誘導(dǎo)斑馬魚肝臟脂肪變性的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

陳博，張靖溥

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所藥理室/衛(wèi)生健康委員會(huì)抗生素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

非酒精性脂肪肝（NAFLD）的發(fā)病呈低齡化趨勢(shì)，本研究旨在建立一種模擬低齡人群的高糖誘導(dǎo)的 NAFLD 模型，揭示其基因表達(dá)譜特征，為疾病的機(jī)制研究和藥物篩選提供基礎(chǔ)。

采用高果糖飲食誘導(dǎo)斑馬魚產(chǎn)生肝臟脂肪變性，油紅 O 染色分析肝臟脂肪變性率，組織病理學(xué)方法觀察肝臟脂質(zhì)堆積，并分析肝臟生化指標(biāo)變化。利用轉(zhuǎn)錄組測序觀察基因表達(dá)譜變化，通過基因與基因組百科全書（KEGG）和基因本體（GO）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行差異基因功能富集，分析其可能影響的信號(hào)通路與生物過程。

斑馬魚幼魚高果糖喂養(yǎng) 10 d 后發(fā)生肝臟脂肪變性，肝臟切片 HE 染色和油紅 O染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，果糖喂飼的幼魚肝臟出現(xiàn)微小脂質(zhì)空泡，呈大面積紅色著色。肝臟甘油三酯、葡萄糖含量顯著高于正常對(duì)照組。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)果糖喂飼的幼魚肝臟表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，共發(fā)現(xiàn) 485 個(gè)差異表達(dá)基因（變化倍數(shù) > 3，< 0.05）。差異基因 KEGG 分析表明，PPAR 信號(hào)通路為顯著富集通路，real-time PCR 結(jié)果確認(rèn) PPAR 通路中 fads2、fabp7b、plin2、adipoqa 基因水平顯著上調(diào)。下調(diào)基因的 GO 分析結(jié)果顯示，病毒防御為顯著富集的生物學(xué)過程。

建立了一種果糖誘導(dǎo)的斑馬魚 NAFLD 模型，可應(yīng)用于斑馬魚幼體肝臟脂肪變性的機(jī)制研究和藥物篩選。能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化可為果糖致 NAFLD 的作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

斑馬魚； 果糖； 非酒精性脂肪肝； 轉(zhuǎn)錄組測序

非酒精性脂肪肝（NAFLD）是慢性肝病的主要誘因之一[1]。越來越多的證據(jù)表明患有NAFLD 的青少年人群亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)呈上升趨勢(shì)[2]。鑒于青少年 NAFLD 患病率的升高以及 NAFLD 和心血管疾病的密切相關(guān)性，通過改善飲食和生活習(xí)慣，同時(shí)開發(fā)有效的治療手段是極為必要的。

日常飲食組成成分與 NAFLD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。高熱量飲食消耗增加，特別是以果糖為甜味劑的大量使用（如碳酸飲料等）與青少年肥胖流行和 NAFLD 的發(fā)病率上升緊密相關(guān)[4]。然而目前多數(shù) NAFLD 動(dòng)物模型主要以模擬成人發(fā)病特征為主，而成人與兒童在營養(yǎng)代謝上存在較大差異，兒童期肥胖常常會(huì)持續(xù)到成年并發(fā)展為代謝綜合征[5]，因此建立一種適用于低齡人群的 NAFLD 動(dòng)物模型具有重要意義。

在本研究中，我們通過果糖喂飼，誘導(dǎo)斑馬魚幼魚發(fā)生肝臟脂肪變性，用以模擬幼體在果糖刺激下形成的 NAFLD，并通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)尋找關(guān)鍵分子靶標(biāo)和信號(hào)通路，以期為低齡人群 NAFLD 的防治提供分子機(jī)制研究的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

AP100 幼魚飼料購自美國Zeigler Bros 公司；總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖檢測試劑盒購自北京普利萊科技有限公司；Trizol 試劑盒購自美國 Invitrogen 公司；SZX10 型顯微鏡購自日本Olympus公司；RM2255 型石蠟切片機(jī)和CM1950型冰凍切片機(jī)均購自德國Leica 公司；LightCycler 96 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 儀購自瑞士Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚飼養(yǎng) AB 系斑馬魚，飼養(yǎng)溫度（28.5 ± 1）℃，14 h 光照/10 h 黑暗循環(huán)。斑馬魚胚胎培養(yǎng)至受精后5 d（5 dpf），給予不同飲食喂飼：對(duì)照組給予 30 mg/d AP100，果糖組給予 30 mg/d AP100 和 0.25%（w/v）果糖，從 5 dpf 繼續(xù)培養(yǎng)至 10 dpf。所有斑馬魚在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前禁食過夜。

1.2.2 斑馬魚整體油紅 O 染色 參考文獻(xiàn)[6]的方法，斑馬魚浸泡在 4% 多聚甲醛中固定過夜，PBS 清洗兩次，60% 異丙醇含 0.3% 油紅O 染色 1 h，PBS（含 0.1% 吐溫 20）再次清洗 2 次，90% 甘油中保存，體式顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 組織學(xué)分析 斑馬魚置于 4% 多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋，石蠟切片機(jī)4 μm 連續(xù)切片。切片經(jīng)蘇木素和伊紅（HE）染色。用于冰凍切片的斑馬魚以 OCT 包埋，冰凍切片機(jī)8 μm 連續(xù)切片，0.5% 油紅 O 染色，倒置顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 生化分析 分離斑馬魚幼魚肝臟，肝臟總膽固醇、甘油三酯、葡萄糖含量依據(jù)檢測試劑盒說明檢測，并以組織蛋白含量為內(nèi)對(duì)照。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR Trizol 法提取組織總 RNA，反轉(zhuǎn)錄為 cDNA，以 cDNA 為模板進(jìn)行real-time PCR。以 β-actin 為內(nèi)對(duì)照，對(duì)照組為外對(duì)照，2-△△CT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物：fads2 F-CCATCGGCACTTCCAGCATCAC，R-TTTCCCA CCACAAAGGCGTTCAG；fabp7b F-AACACAGA GTACCTTCAAG，R-AGTTTCATCACCATCTTCC；adipoqa F-TTCACATATCACCTCACCATC，R-GAA GCCAAACCTCATCTCC；plin2 F-ACAGCAGCCTC AGTAAAG，R-GAGCAGGTAGTCCATCAC。

1.2.6 RNA測序與分析 總 RNA 提取，樣品質(zhì)量檢測，樣品檢測合格后進(jìn)行文庫構(gòu)建，Illumina Hiseq 4000 平臺(tái)測序，原始數(shù)據(jù)分析由北京康普森生物科技有限公司完成。對(duì)獲取到的各樣本中的轉(zhuǎn)錄本 reads 數(shù)使用 DESeq 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算差異比較的值和變化倍數(shù)，以< 0.05 的差異轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行 GO 和 KEGG 富集分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 果糖誘導(dǎo)斑馬魚幼魚肝臟脂肪變性

5 dpf 的幼魚給予 0.25% 的果糖處理，持續(xù) 10 d。結(jié)果表明與對(duì)照組相比較，果糖處理組幼魚體重?zé)o明顯變化，體長顯著增加。油紅 O 染色結(jié)果表明，果糖處理組幼魚肝臟區(qū)域有明顯紅色著色，提示肝臟產(chǎn)生脂肪堆積。肝臟石蠟切片 HE 染色結(jié)果表明，果糖處理組幼魚肝臟呈現(xiàn)出微小空泡，提示肝臟發(fā)生脂肪變性。肝臟生化分析結(jié)果表明，果糖處理組幼魚肝臟的甘油三酯、葡萄糖含量顯著升高，膽固醇水平?jīng)]有明顯變化，肝臟脂肪變性率顯著升高（圖 1）。以上結(jié)果表明階段性果糖喂飼可導(dǎo)致斑馬魚幼魚肝臟脂肪變性。

2.2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

在果糖處理結(jié)束后，我們分別從兩組斑馬魚肝臟中提取了總 RNA，利用 RNA-seq 技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。首先分別在對(duì)照組和果糖處理組讀取到了 34 647 769 和 39 055 155 個(gè)原始序列，經(jīng)過濾后得到 33 984 509 和 38 160 017 個(gè)序列數(shù)。過濾后的總堿基數(shù)分別為 10.2 G 和 11.45 G。平均堿基測序錯(cuò)誤率小于 0.03%。GC 含量占總堿基數(shù)比例分別為 45.23% 和 46.25%。然后通過 STAR 軟件與斑馬魚基因組信息比對(duì)。兩組的唯一比對(duì)序列讀數(shù)分別為 29 996 555 和 34 138 835，配對(duì)百分比數(shù)相似，分別為 88.27% 和 89.46%。新增序列讀數(shù)分別為 1 474 890 和 1 672 991，數(shù)據(jù)質(zhì)量滿足分析要求。

2.3 差異基因表達(dá)分析

為研究果糖影響幼魚肝臟生理的相關(guān)機(jī)制，我們進(jìn)一步分析其基因表達(dá)模式，聚類分析表明果糖喂飼的斑馬魚展現(xiàn)出明顯的差異基因表達(dá)譜（圖 2A）。與對(duì)照組相比較，果糖處理組共發(fā)現(xiàn)了 485 個(gè)差異表達(dá)基因（變化倍數(shù) > 3，< 0.05），其中 283 個(gè)基因上調(diào)，202 個(gè)基因下調(diào)（圖 2B）。我們分析了已知的差異表達(dá)基因中，上調(diào)和下調(diào)倍數(shù)最高的前 20 個(gè)基因（圖 2C）。其中上調(diào)倍數(shù)最高的 adipoqa 基因與能量代謝相關(guān)的 PPAR 通路和脂肪因子信號(hào)通路相關(guān)，提示果糖飲食可能誘發(fā)體內(nèi)能量代謝失衡。

2.4 差異基因 KEGG 和 GO 歸類分析

分別對(duì)差異上調(diào)基因、下調(diào)基因進(jìn)行 GO 富集分析。其中上調(diào)差異基因富集到的 GO生物過程包括：細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、氧氣輸送、固醇類代謝過程等，提示飲食中的果糖可能影響斑馬魚生長發(fā)育。下調(diào)差異基因富集到的 GO 生物過程包括：對(duì)病毒的防御反應(yīng)，硫化物轉(zhuǎn)運(yùn)，硫酸鹽、氯離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，草酸轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞 pH 調(diào)節(jié)能力等，提示果糖喂飼可能影響了斑馬魚對(duì)微生物入侵的防御能力（圖 3）。

圖 1 果糖喂飼對(duì)斑馬魚生長及肝臟脂肪變性的影響[A：斑馬魚整體油紅O 染色；B：斑馬魚肝臟 HE 染色（40 ×）；C：斑馬魚肝臟油紅 O 染色（40 ×）；D：斑馬魚體長、體重及生化指標(biāo)；與對(duì)照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001]

Figure 1 The effects of fructose diet feeding on the growth and hepatic steatosis in larval zebrafish [A: Whole body oil red O staining; B: Liver HE staining (40 ×); C: Liver oil red O staining (40 ×); D: Body length, body weight and biochemical factors;*< 0.05,**< 0.01,***< 0.001 compared with the control]

對(duì)總的差異基因進(jìn)行 KEGG 分析，在果糖喂飼的斑馬魚肝臟中，6 個(gè)顯著差異表達(dá)基因歸屬到 PPAR 信號(hào)通路（圖 4），包括 fads2、fabp7b、plin2、adipoqa、cyp7a1、cyp27a1.2，這些基因不僅在肝臟表達(dá)，還表達(dá)在骨骼肌與脂肪組織。PPAR 信號(hào)通路與能量代謝密切相關(guān)，結(jié)果提示果糖可能對(duì)肝臟脂質(zhì)代謝、幼魚早期脂肪分化產(chǎn)生影響。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)以上 6 個(gè)基因的相互作用進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn) fads2、fabp7b、plin2 可能存在間接的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步研究提供思路（圖 5）。

2.5 Real-time PCR 分析 PPAR 通路差異基因

為驗(yàn)證 RNA-seq 的檢測結(jié)果，我們利用 real-time PCR 對(duì) PPAR 信號(hào)通路中 4 個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，果糖喂飼組 fads2、fabp7b、plin2、adipoqa 基因表達(dá)顯著上調(diào)，與 RNA 測序結(jié)果相似（圖 6）。

3 討論

NAFLD 以肝細(xì)胞的脂質(zhì)過量累積為基本特征，疾病譜涵蓋單純的肝臟脂肪變性乃至非酒精性脂肪肝炎。非酒精性脂肪肝能導(dǎo)致終末期肝病，如肝纖維化、肝癌，同時(shí)還與心血管疾病相關(guān)[7]。全球非酒精性脂肪肝發(fā)病率為 2.8% ~ 46%。近年來，兒童的 NAFLD 發(fā)病率呈快速上升趨勢(shì)，由于其發(fā)病較成人更快，已經(jīng)成為一個(gè)日益嚴(yán)重的公共健康問題[8-9]。

Figure 2 Overview of gene expression profiling of liver in control and fructose group (A: Gene clustering base on gene expression profiles; B: The volcano plot of different genes showing log fold change; C: The top 40 of changed DEG between fructose and control group in zebrafish)

Figure 3 Significantly up-regulated (A) and down-regulated (B) genes assigned to GO biological process

圖 4 基于 KEGG 的 PPAR 信號(hào)通路的差異表達(dá)基因的分析歸類（紅色：顯著上調(diào)基因；綠色：顯著下調(diào)基因）

Figure 4 Significantly differentially expressed genes identified by KEGG as involved in PPAR signaling parthway (Red: Significantly increased expression; Green: Significantly decreased expression)

圖 5 生物信息學(xué)方法預(yù)測基因-基因相互作用

Figure 5 The gene-gene interaction network was forecasted by bioinformatics method

相對(duì) mRNA 水平Relative mRNA level5045403530255 4 3 2 1 0 fads2 fabp7b adipoqa plin2

Figure 6 Validation of four differentially expressed genes selected from PPAR pathway by qRT-PCR (*< 0.05 compared with the control group)

大量研究表明，由于經(jīng)濟(jì)水平的提升，我國當(dāng)代人飲食習(xí)慣的改變是導(dǎo)致肥胖率迅速上升的主要原因之一[10]。兒童和青少年是含糖高熱量飲食的主要消耗群體。已有研究表明果糖攝入與 NAFLD 發(fā)生發(fā)展有關(guān)[11]。攝入大量果糖的 NAFLD 患者，其果糖激酶基因表達(dá)量較普通人更多[4]。在嚙齒類動(dòng)物模型中，果糖攝入增加脂肪生成，脂肪酸氧化降低，增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及損傷胰島素信號(hào)[12]。

斑馬魚已經(jīng)成為一種公認(rèn)的研究發(fā)育和疾病的模式動(dòng)物。相較于其他模式動(dòng)物，其繁殖迅速，在胚胎和幼體時(shí)期身體透明，因此適合基于疾病表型的高通量篩選和基礎(chǔ)分子機(jī)制研究。與人類相比，斑馬魚的肝膽系統(tǒng)在解剖學(xué)和分子水平上高度保守，且在受精后第 5 天接近發(fā)育完全。斑馬魚的成魚和幼魚均可發(fā)展為肝臟脂肪變性，病理過程與人類相似[13]。目前已有多種基于藥理學(xué)和基因技術(shù)手段建立的斑馬魚肝臟脂肪變性模型[14]。本研究采用果糖喂飼斑馬魚幼魚用以模擬低齡人群 NAFLD 早期發(fā)展，結(jié)果表明，階段性的果糖喂飼可促進(jìn)斑馬魚生長，但并未導(dǎo)致肥胖。普通的高脂飲食在誘導(dǎo)肥胖的同時(shí)造成肝臟脂質(zhì)堆積[15]，而高果糖飲食可獨(dú)立誘導(dǎo)斑馬魚肝臟脂肪變性和損傷，促進(jìn)肝臟脂質(zhì)堆積。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是一種高通量測序方法，我們利用該方法觀察果糖誘導(dǎo)的斑馬魚脂肪變性的轉(zhuǎn)錄組特征，為其發(fā)病機(jī)制提供分子基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明果糖喂飼后斑馬魚肝臟基因表達(dá)譜特征發(fā)生明顯變化。差異下調(diào)基因的 GO 功能注釋結(jié)果表明，果糖喂飼可能降低幼魚對(duì)病毒和其他生物的防御反應(yīng)，這可能是攝入高果糖飲食的潛在風(fēng)險(xiǎn)之一。KEGG 分析得到 PPAR 信號(hào)通路的顯著富集，提示機(jī)體能量平衡受影響。模型組肝臟 adipoqa 基因表達(dá)水平極顯著升高，可能是機(jī)體應(yīng)對(duì)果糖壓力的代償性反應(yīng)，而幼體與成體基因調(diào)控差異較大，adipoqa 長期被激活是否會(huì)誘發(fā)其他疾病還需深入研究。Adipoqa 是人adiponectin 同源基因，與 2 型糖尿病、肥胖、冠心病等密切相關(guān)[16]。研究表明，在非酒精性脂肪肝病人中，adiponectin 水平與亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化事件顯著相關(guān)[17]。血清 adiponectin 水平的異常變化可能作為兒童 NAFLD 的診斷標(biāo)志物[18]。這些研究提示本實(shí)驗(yàn)所建模型能一定程度模擬臨床疾病的病理過程，具有深入研究的價(jià)值。

綜上，本研究提供了一種以現(xiàn)階段國民飲食習(xí)慣——果糖為誘因的模擬低齡人群 NAFLD 發(fā)生發(fā)展的動(dòng)物模型及其主要的基因表達(dá)譜特征，為進(jìn)一步的機(jī)制研究或藥物篩選提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

志謝 感謝本實(shí)驗(yàn)室孟杰老師在斑馬魚飼養(yǎng)過程中的辛勤工作

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Transcriptomic analysis of fructose induced liver steatosis in larval zebrafish

CHEN Bo, ZHANG Jing-pu

Department of Pharmacology, Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, the National Health CommissionThe Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

The prevalence of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is increasing in young people. The purpose of this study was to establish a sugar-induced NAFLD model and reveal the characteristics of its gene expression profile for the mechanism studies of NAFLD and drug screening in youth.

Zebrafish larvae were fed with a high fructose diet or normal diet respectively. The liver steatosis was analyzed by hepatic lipid accumulation and biological indexes. Transcriptome sequencing was employed to observe the changes of gene expression profile, and the functional enrichment of differentially expressed genes was conducted by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) and Gene Ontology (GO) database.

Zebrafish larvae were fed with a high fructose diet for 10 days developed liver steatosis. The results of pathological showed that lipid vacuoles appeared in the liver of the fructose fed larvae with red staining. The triglyceride and glucose contents of liver were significantly increased in fructose group compared with the control group. Transcriptome sequencing showed significant changes of gene expression profile in fructose-fed larvae. A total of 485 differentially expressed genes were identified (change fold > 3,< 0.05). Analysis of the differentially expressed genes by KEGG showed that PPAR signaling pathway was significantly enriched. Four genes involved in PPAR pathway were validated by real-time PCR. The GO analysis from down-regulated gene showed that GO term: defense response to virus was significantly enriched.

This study has established a fructose-induced zebrafish NAFLD model. Particularly, variant expression of energy metabolism related genes in fatty livers supports a role of fructose diet in NAFLD pathology and provides a foundation for mechanism studies and drug screening of NAFLD.

Zebrafish; Fructose; Nonalcoholic fatty liver disease; RNA-seq

ZHANG Jing-pu, Email: zhangjingpu@imb.pumc.edu.cn

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（81603172）；協(xié)和青年科研基金（3332016064）

張靖溥，Email：zjp5577@126.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.04.004

2019-04-08