心肌營(yíng)養(yǎng)素-1對(duì)抗NMDA受體腦炎致海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用

李振宏 黃濤

【摘要】 目的：研究營(yíng)養(yǎng)素-1（CT-1）干預(yù)治療抗N-甲基-D-天門冬氨酸（NMDA）受體腦炎誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制，為抗NMDA受體腦炎提供新的治療靶點(diǎn)。方法：選擇剛出生的SD大鼠培養(yǎng)原代神經(jīng)元細(xì)胞，把原代神經(jīng)元細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組﹑對(duì)照組和正常組，分別建立抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型，在實(shí)驗(yàn)組中加入CT-1（10 ng/mL），應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法、免疫組織化學(xué)和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)等技術(shù)，檢測(cè)CT-1對(duì)抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用以及細(xì)胞凋亡基因Caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果：各種濃度的谷氨酸均能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率高而死亡率并不高;加入CT-1神經(jīng)元細(xì)胞，第1、2、3天，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率均高于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率、Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞率均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：CT-1對(duì)抗NMDA受體腦炎導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用，可能是通過(guò)促使凋亡基因Caspase-3表達(dá)下調(diào)，減少細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而對(duì)抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷起到保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 抗NMDA受體腦炎; 神經(jīng)元; 損傷; 心肌營(yíng)養(yǎng)素-1

【Abstract】 Objective：To study the protective effect and mechanism of cardiotrophin-1（CT-1）intervention on neuronal injury induced by anti-NMDA-receptor encephalitis and to provide a new therapeutic target for anti-NMDA-receptor encephalitis.Method：The primary neuron cells were cultured in newly born SD rats，they were divided into experimental group，control group and normal group，neuronal injury models induced by anti-NMDA-receptor encephalitis were established，CT-1（10 ng/mL）was added to experimental group.Trypan blue staining，immunohistochemistry and TUNEL cell apoptosis detection were used to detect the protective effect of CT-1 on neuronal injury induced by NMDA receptor encephalitis and the expression level of Caspase-3.Result：All concentrations of glutamate could induce neuronal apoptosis，when the concentration of glutamate was 100 and 200 μmol/L，the apoptotic rate was high and the mortality rate was not high.On the 1st，2nd and 3rd day after adding CT-l neurons，the survival rate of experimental group were higher than those of control group，and the apoptotic rate and Caspase-3 positive cell rate were lower than those of control group，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion：CT-1 has protective effect against neuronal injury induced by anti-NMDA-receptor encephalitis，which may be through down-regulation of Caspase-3 expression and reduction of apoptosis，thereby protecting neurons from NMDA receptor encephalitis-induced neuronal injury.

【Key words】 Anti-NMDA-receptor encephalitis; Neuron; Injury; Cardiotrophin-1

First-authors address：Ganzhou Hospital Affiliated to Nanchang University，Ganzhou 341000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.10.006

抗N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體腦炎是一種起病時(shí)臨床表現(xiàn)不典型，易被臨床工作者忽視的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，心肌營(yíng)養(yǎng)素-1（cardiotrophin-1，CT-1）是Pennica等于1995年發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子，與睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、白血病抑制因子、白介素6等同屬促神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族[1-2]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)CT-l對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有重要作用，可通過(guò)其特異性受體對(duì)神經(jīng)元起保護(hù)作用[3-5]。本研究針對(duì)抗NMDA受體腦炎的發(fā)病機(jī)制，通過(guò)建立抗NMDA受體腦炎體外培養(yǎng)模型，觀察CT-1對(duì)抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，了解CT-1對(duì)神經(jīng)元的作用和機(jī)制，為抗NMDA受體腦炎的臨床研究提供新的靶點(diǎn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇剛出生的SD大鼠，進(jìn)行原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng) 選擇剛出生的SD大鼠，用眼科鑷取出海馬，D-Hanks液清洗后，剪成1 mm3左右的小塊，在37 ℃溫度下用0.25%胰蛋白酶消化組織小塊后，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度為1×106/mL，接種于經(jīng)0.01%多聚賴氨酸預(yù)處理的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)9 d后，經(jīng)過(guò)NF-200免疫細(xì)胞組織化學(xué)法鑒定，神經(jīng)元占培養(yǎng)細(xì)胞的90%以上。

1.2.2 建立抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型 當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至第9天，隨機(jī)選取60個(gè)標(biāo)本為實(shí)驗(yàn)1組，15個(gè)樣本為對(duì)照1組，將實(shí)驗(yàn)1組均分為4個(gè)小組，分別加入不同濃度谷氨酸（100、200、300、400 μmol/L），對(duì)照1組不加任何藥品處理，實(shí)驗(yàn)1組中不同濃度的谷氨酸與神經(jīng)元細(xì)胞作用15 min后更換新鮮培養(yǎng)液，24 h后進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)。（1）臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率：神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，隨機(jī)計(jì)數(shù)15個(gè)視野中藍(lán)染神經(jīng)元數(shù)，死亡細(xì)胞被染成藍(lán)色，未著色的細(xì)胞為存活細(xì)胞。神經(jīng)元存活率=神經(jīng)元存活數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。（2）TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)TUNEL檢測(cè)，隨機(jī)計(jì)數(shù)15個(gè)視野中深棕色神經(jīng)元數(shù)，凋亡細(xì)胞被染成深棕色，未著色的細(xì)胞為存活細(xì)胞。神經(jīng)元凋亡率=神經(jīng)元凋亡數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3 CT-1對(duì)抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用 另隨機(jī)選取原代神經(jīng)元細(xì)胞45個(gè)標(biāo)本，將其均分為實(shí)驗(yàn)組﹑對(duì)照組和正常組，各15個(gè)標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)組在加谷氨酸前1天加入CT-1（10 ng/mL），對(duì)照組中加入相同劑量緩沖液，正常組不做處理。當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至第9天，將低濃度谷氨酸（100 μmol/L）加入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，15 min后換回正常細(xì)胞培養(yǎng)液，正常組不加入谷氨酸。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至1﹑2、3 d進(jìn)行細(xì)胞存活率、凋亡率和細(xì)胞凋亡基因Caspase-3表達(dá)水平。Caspase-3基因表達(dá)檢測(cè)：采用免疫組化方法檢測(cè)Caspase-3基因表達(dá)，隨機(jī)計(jì)數(shù)15個(gè)視野中陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)和總神經(jīng)元數(shù)，神經(jīng)元中有棕色著色者為陽(yáng)性神經(jīng)元，Caspase-3基因陽(yáng)性表達(dá)率=陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)/神經(jīng)元總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原代神經(jīng)元培養(yǎng)和鑒定 神經(jīng)元細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，可見(jiàn)細(xì)胞為懸浮在培養(yǎng)液中的小圓形細(xì)胞，邊界清楚，細(xì)胞密度很高;1 d后在培養(yǎng)瓶壁上可見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞基本貼壁，少數(shù)細(xì)胞可見(jiàn)軸突生長(zhǎng)，軸突長(zhǎng)度約占細(xì)胞體的一半;2 d后大多數(shù)細(xì)胞有軸突生長(zhǎng)，長(zhǎng)度約為胞體的2～3倍;3 d后神經(jīng)元細(xì)胞胞體變大，軸突長(zhǎng)度增長(zhǎng)不明顯;第4～5天可見(jiàn)許多細(xì)胞碎片，為崩解的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞;培養(yǎng)第8天，軸突逐漸增長(zhǎng)，彼此相互連接，形成網(wǎng)狀，見(jiàn)圖1;細(xì)胞培養(yǎng)第9天，免疫組織化學(xué)鑒定神經(jīng)元，神經(jīng)元細(xì)胞及其軸突被染成棕色，棕色陽(yáng)性細(xì)胞占全部細(xì)胞的90%以上，見(jiàn)圖2。

2.2 抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷模型分析 臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)，不同濃度的谷氨酸作用于神經(jīng)元細(xì)胞6 h后，可見(jiàn)部分細(xì)胞胞體腫脹，細(xì)胞軸突變短，1 d后部分腫脹細(xì)胞裂解;TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，不同濃度的谷氨酸作用于神經(jīng)元細(xì)胞1 d后，神經(jīng)元細(xì)胞體積變小，細(xì)胞核固縮;各種濃度的谷氨酸均能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，實(shí)驗(yàn)1組不同濃度谷氨酸組細(xì)胞存活率均低于對(duì)照1組，凋亡率均高于對(duì)照1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且隨著谷氨酸濃度逐漸升高，神經(jīng)元細(xì)胞的存活率逐漸下降，細(xì)胞凋亡率逐漸上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而升高，而濃度為200﹑300﹑400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而下降，見(jiàn)表1和圖3、4。

2.3 CT-1對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用

2.3.1 細(xì)胞凋亡率、存活率比較 當(dāng)神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至第9天，加入100 μmol/L谷氨酸誘導(dǎo)凋亡后，TUNE檢測(cè)顯示：第1、2、3天，正常組細(xì)胞凋亡率均低于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;臺(tái)盼藍(lán)染色顯示：第1、2、3天，正常組細(xì)胞存活率均高于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2、圖5～9。

2.3.2 Caspase-3基因表達(dá)情況分析 細(xì)胞免疫組化技術(shù)檢測(cè)Caspase-3蛋白在神經(jīng)元細(xì)胞中的表達(dá)情況，Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞可見(jiàn)神經(jīng)元胞漿和軸突著色;凋亡后第1、2、3天，正常組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞率均低于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表3和圖10、11。

3 討論

抗NMDA受體腦炎是一種起病時(shí)臨床表現(xiàn)不典型，易被臨床工作者忽視的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，主要累及人體大腦邊緣系統(tǒng)，典型臨床表現(xiàn)以精神異常與癲癇發(fā)作為特征，其中大多數(shù)病人由腫瘤、感染等引起[6-12]?？筃MDA受體腦炎的發(fā)病機(jī)制迄今尚未完全闡明，目前大部分學(xué)者認(rèn)為該病是抗NMDA抗體介導(dǎo)的免疫損傷所致，NMDA受體是一種谷氨酸離子型受體，由多種亞基組成的異四聚體，屬電壓門控通道，大量存在于大腦神經(jīng)細(xì)胞中，其中主要分布在大腦海馬區(qū)等邊緣系統(tǒng)，功能主要是調(diào)節(jié)突觸傳遞及促發(fā)突觸重塑，異常激活常導(dǎo)致驚厥發(fā)作、精神異常等臨床表現(xiàn)[13-17]。

本研究在神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至第10天，當(dāng)神經(jīng)元發(fā)育成熟，細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，用不同濃度的谷氨酸作用于神經(jīng)元細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，各種濃度的谷氨酸均能誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，實(shí)驗(yàn)1組不同濃度谷氨酸組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照1組，且隨著谷氨酸濃度逐漸升高，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率逐漸上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而升高，而濃度為200﹑300﹑400 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率隨著谷氨酸濃度的升高而下降。而且本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)1組不同濃度谷氨酸組細(xì)胞存活率均低于對(duì)照1組，且隨著谷氨酸濃度逐漸升高，神經(jīng)元細(xì)胞的存活率逐漸下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由于谷氨酸濃度為100﹑200 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率高而細(xì)胞死亡率并不高，提示100﹑200 μmol/L的谷氨酸為誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的最佳濃度。在證實(shí)了低濃度的谷氨酸可引起神經(jīng)元凋亡之后，筆者在使用谷氨酸誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的前1天，在實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元細(xì)胞中加入CT-1，然后采用TUNEL檢測(cè)和臺(tái)盼藍(lán)染色等方法來(lái)評(píng)價(jià)CT-1對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，第1、2、3天，正常組細(xì)胞凋亡率均低于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），正常組細(xì)胞存活率均高于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，且實(shí)驗(yàn)組均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明加入了CT-1的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯高于對(duì)照組，而細(xì)胞凋亡率卻明顯低于對(duì)照組，提示CT-1對(duì)抗NMDA受體腦炎導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷具有抑制作用，對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用。而其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，可能主要是通過(guò)抑制凋亡的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，其在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮作用。Caspase-3正常以酶原的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段被激活，活化的Caspase-3由兩個(gè)大亞基和兩個(gè)小亞基組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18-20]。在抗NMDA受體腦炎導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡的機(jī)制中，為探究有無(wú)Caspase-3的參與，而CT-1對(duì)其表達(dá)有無(wú)抑制作用，筆者作了Caspase-3免疫組化，結(jié)果顯示：凋亡后第1、2、3天，正常組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞率均低于實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（P<0.05），提示谷氨酸損傷使Caspase-3蛋白表達(dá)增加，Caspase-3參與了抗NMDA受體腦炎導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡的機(jī)制;實(shí)驗(yàn)組Caspase-3蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（P<0.05），提示CT-1可抑制Caspase-3蛋白表達(dá)，因此其抑制凋亡的作用可能與抑制Caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究提示低濃度谷氨酸可作為抗NMDA受體腦炎導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡的良好模型，CT-1對(duì)抗NMDA受體腦炎導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用，可能是通過(guò)促使凋亡基因Caspase-3表達(dá)下調(diào)，減少細(xì)胞凋亡發(fā)生，從而對(duì)抗NMDA受體腦炎誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷起到保護(hù)作用。

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（收稿日期：2018-08-13） （本文編輯：董悅）