豬源抗菌肽PR-39的抗菌性能及其熱穩(wěn)定性的測(cè)定

付雪麗 田 奎 劉凱迪 王浩杰 劉保國(guó) 李月濤 胡建和

(河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

抗菌肽（AMPs）是生物體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種具有生物活性的小分子多肽。天然生物抗菌肽抗菌譜相對(duì)較為廣泛，在特性上表現(xiàn)出突出的水溶性、熱穩(wěn)定性，在高等動(dòng)物正常細(xì)胞環(huán)境中，不存在毒害性，且不易產(chǎn)生耐藥性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在各種動(dòng)物組織中發(fā)現(xiàn)具備抗菌特性的多肽、蛋白質(zhì)種類已超出千種，且有70余種的結(jié)構(gòu)已被測(cè)定。豬源抗菌肽PR-39是抗菌肽中的重要一種，它是從豬體內(nèi)分離得到的抗菌肽，具有良好的抑菌效果。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)抗菌肽的最小抑菌濃度進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)耐熱性等，為該類產(chǎn)品應(yīng)用于畜牧科研領(lǐng)域提供一定的數(shù)據(jù)與資料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用的抗菌肽PR-39通過(guò)質(zhì)譜鑒定，其純度指標(biāo)超出了98%，系上海吉爾生化企業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)品。在本分析中，選用的鼠傷寒沙門氏菌CVCC541、金黃色葡萄球菌（923）鼠 傷均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。①液體培養(yǎng)基：MH液體培養(yǎng)基200ml高壓滅菌20min，121℃②固體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基每100ml需加胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，另加瓊脂粉1.5g（高壓滅菌20min，121℃，備用）。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)品配制

選取一定量的抗菌肽產(chǎn)品，要求使用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行配置，配置溶液的標(biāo)準(zhǔn)濃度為1、2mg/ml。

1.2.2 抗菌肽產(chǎn)品抗菌活性的測(cè)定

（1）雙層瓊擴(kuò)法測(cè)定抑菌活性

在這里應(yīng)用的是LB固體培養(yǎng)基，即一般的瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行4h時(shí)間的活化培養(yǎng)，然后對(duì)菌液濃度進(jìn)行稀釋處理，處理標(biāo)準(zhǔn)要求達(dá)到106～107CFU/ml。然后對(duì)活化后的細(xì)菌進(jìn)行兩次離心來(lái)達(dá)到純化的目的。吸取純化后的菌液于裝有LB固體培養(yǎng)基中（此時(shí)為液體狀態(tài)，溫度大約50℃左右），每100ml培養(yǎng)基中加入334μl的菌液。將培養(yǎng)基倒入瓊脂板中，等待凝固后進(jìn)行打孔，每個(gè)板打三個(gè)孔，分別注入20μl濃度為2mg/mL的抗菌肽、20μl相同濃度的氨芐霉素、20μl的水（陰性對(duì)照）。將平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)，溫度設(shè)定為37℃，在培養(yǎng)24h后對(duì)小孔周圍作仔細(xì)觀察，記錄是否出現(xiàn)菌圈與菌圈具體的規(guī)模。

（2）最小抑菌濃度的測(cè)定（MIC測(cè)定）

將細(xì)菌在LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，然后放37℃恒溫培養(yǎng)16-18h左右。挑取菌落接種到5mlMH液體培養(yǎng)基中，放搖床上，37℃，180rmp/min，大約搖12h左右。吸取100μl菌液于4.5mlMH液體培養(yǎng)基繼續(xù)放在搖床上，180rmp/min搖4h活化（此時(shí)菌液濃度為108CFU/ml）。然后用MH液體培養(yǎng)基將上述菌懸液以1：1000比例進(jìn)行稀釋，使菌液濃度達(dá)到105.CFU/ml。向96孔板每孔中分別加入100μl混勻后的MH菌懸液至第11排。吸取100μl濃度為1mg/ml的抗菌肽溶液添加到第一個(gè)孔中，反復(fù)吹打均勻，盡量不要有氣泡，（槍頭最好在液面以下吹打），然后從第一個(gè)孔中吸取100μL液體至第二個(gè)孔中，吹打均勻，以此類推，重復(fù)此操作至第10孔，吸取100μl液體棄去，此時(shí)每孔中的抗菌肽濃度分別為：2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7、2-8、2-9、2-10、單位：mg/ml）。第11孔中不加抗菌肽，作陰性對(duì)照。第12孔中加入50μl濃度為1mg/ml的抗菌肽溶液與50μl的空白MH培養(yǎng)基，作陽(yáng)性對(duì)照。將96孔板蓋上蓋子置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度設(shè)定為37℃，時(shí)間控制在16～18h范圍內(nèi)，對(duì)細(xì)菌最小抑制濃度進(jìn)行分析與記錄。

1.2.3 抗菌肽產(chǎn)品熱穩(wěn)定性的測(cè)定

完成各種濃度藥液配置之后，將溶液置于99.2℃的沸水環(huán)境中進(jìn)行水浴，水浴時(shí)間分別設(shè)定為5、10、20、30min，然后分別記錄其對(duì)鼠傷寒沙門氏菌所表現(xiàn)出的抑制效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽抗菌活性的測(cè)定

2.1.1 抗菌肽的抗菌活性效果

經(jīng)過(guò)仔細(xì)對(duì)比，同濃度下抗菌肽PR-39的抑菌圈的直徑長(zhǎng)度發(fā)現(xiàn)，如圖1所示，圖（a）直徑長(zhǎng)度約11mm，圖（b）直徑長(zhǎng)度約為12.6mm，圖（c）直徑長(zhǎng)度約為14.6mm，說(shuō)明抗菌肽PR-39的抑菌效果確實(shí)明顯。金黃色葡萄球菌加入抗菌肽PR-39的抑菌效果如圖2所示。

圖1 鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

圖2 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌加入抗菌肽（A表示2mg/ml的氨芐霉素，P表示2mg/ml抗菌肽產(chǎn)品PR-39，水是陰性對(duì)照）

2.1.2 PR-39最小抑菌濃度的測(cè)定

采用2-10～2-1mg/ml10個(gè)濃度梯度，運(yùn)用二倍稀釋法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1～5孔中的菌液變得清澈透明，第6～11孔中菌液渾濁，所以鼠傷寒沙門氏菌的最小抑菌濃度為2-5mg/mL，試驗(yàn)結(jié)果如圖3。

圖3 最小抑菌濃度測(cè)定試驗(yàn)

2.2 抗菌肽產(chǎn)品熱穩(wěn)定性的測(cè)定

完成各種濃度藥液配置之后，將溶液置于99.2℃的沸水環(huán)境中進(jìn)行水浴，水浴時(shí)間分別設(shè)定為5、10、15、20、30min，然后分別記錄其對(duì)鼠傷寒沙門氏菌所表現(xiàn)出的抑制效果。具體可以觀看圖4。分析了解到，水浴分別為5、10、15min時(shí)，抗菌肽所表現(xiàn)出的抗菌效果是較為突出的，抑菌圈相對(duì)偏大。而在水浴20、30min時(shí)，雖仍存在有抑菌圈，但很明顯抑菌圈變小。這意味著，抗菌肽產(chǎn)品在高溫條件下仍可以發(fā)揮作用，但隨時(shí)間增加，其對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制性能有所減弱。

圖4 不同溫度對(duì)抗菌肽產(chǎn)品抗菌活性的影響

3 討論

3.1 抗菌肽產(chǎn)品抗菌性能和最小抑菌濃度

依據(jù)試驗(yàn)觀察可知，該抗菌肽產(chǎn)品具備相當(dāng)好的抗菌性能，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)出十分優(yōu)秀的抑制性能，而對(duì)于金黃色葡萄球菌而言，其抑菌圈并不顯著，這也表明，這兩種細(xì)菌對(duì)抗菌肽產(chǎn)品的敏感性是存在著明顯差異的。本次試驗(yàn)是用雙層瓊擴(kuò)法測(cè)出抗菌肽PR-39在濃度為2mg/ml時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌都具有抑菌性，但對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑制效果較好。隨后以鼠傷寒沙門氏菌為試驗(yàn)菌做抗菌肽PR-39最小抑菌濃度測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果最小抑制濃度表現(xiàn)為10-5mg/ml。在對(duì)多種指標(biāo)進(jìn)行全面考慮的基礎(chǔ)上，可以將10-5mg/ml界定為最佳濃度。該濃度標(biāo)準(zhǔn)不僅可以降低抗菌肽產(chǎn)品的應(yīng)用量，還可以有效保障抗菌效果達(dá)到預(yù)期。彭榮在分析過(guò)程中，通過(guò)粉紋夜蛾離體細(xì)胞對(duì)抗菌肽性能作了進(jìn)一步分析，其試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這類抗菌肽的抗微生物活性相對(duì)較廣，抑菌活性較為突出，尤其是針對(duì)植物病原真菌中的小麥赤霉病菌、花生白絹病菌，革蘭氏陰性菌中的大腸桿菌、沙門氏菌，酵母菌的白色念珠茵等作用突出。在這些抑菌活性中，效果最佳的是白色念珠菌、大腸桿菌，其次則是金黃色普通球菌，其他菌種效果偏弱。在2008年，劉慧明等人針對(duì)鱟抗菌肽作了深入的試驗(yàn)與分析，發(fā)現(xiàn)其對(duì)枯草桿菌、隱球菌有著十分突出的抑制作用，但分析也發(fā)現(xiàn)，該類抗菌肽對(duì)于變形桿菌沒(méi)有作用。此外，更多的分析與大量的數(shù)據(jù)也表明，抗菌肽種類不同，在實(shí)際應(yīng)用中的抗菌性能也表現(xiàn)出一定的差異，且所對(duì)應(yīng)的最小抑制濃度也并不一致。從抗菌機(jī)理的視角來(lái)闡釋，即抗菌肽可以對(duì)細(xì)菌質(zhì)膜結(jié)構(gòu)作出改變或破壞，繼而引起膜穿孔，從而生成溶質(zhì)通道或離子，促使細(xì)胞內(nèi)容物大量滲出，繼而讓細(xì)菌失去活性并死亡，也可以對(duì)細(xì)菌的呼吸進(jìn)行抑制，或阻礙細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成等。

3.2 溫度對(duì)抗菌肽產(chǎn)品抑菌活性的影響

許兵紅等在深入分析之后了解到，對(duì)于果絲光綠蠅幼蟲(chóng)，選擇應(yīng)用針刺誘導(dǎo)的方式獲得抗菌肽，然后在100℃沸水中進(jìn)行一分鐘水浴，此時(shí)其仍存在著良好的抗菌活性，但在水浴持續(xù)三分鐘時(shí)間后，其活性會(huì)喪失。如選擇在80℃與60℃水溫中進(jìn)行水浴，持續(xù)五分鐘后仍存在著抗菌活性。這也表明，該類抗菌肽抑菌活性存在著一定熱穩(wěn)定性，溫度不同，熱穩(wěn)定性也存在著變化。針對(duì)稻蝗抗菌肽、乳酪蛋白來(lái)源抗菌肽也做了相應(yīng)的分析，發(fā)現(xiàn)溫度過(guò)高，也會(huì)導(dǎo)致其抑菌效果下降。在本分析中使用的抗菌肽PR-39，通過(guò)高溫處理仍存在著較好作用，表明其熱穩(wěn)定性較為優(yōu)秀。在100℃沸水中進(jìn)行水浴，持續(xù)30min依然對(duì)鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)出突出的抑制性能，但超出30min后，其抗菌圈已是十分小，且周圍分布有細(xì)菌，這也意味著其抗菌性逐漸喪失，這些研究成果與以上學(xué)者分析結(jié)果一致。

3.3 抗菌肽PR-39的抗菌機(jī)理

對(duì)于細(xì)菌本身而言，其存在著細(xì)胞壁與細(xì)胞膜，這也會(huì)對(duì)抗菌肽構(gòu)成抵抗力，細(xì)胞中的脂多糖在抵抗抗菌肽中發(fā)揮著突出作用，為此，在應(yīng)用中需要思考采取一定的方法，將革蘭氏陰性菌脂多糖凈負(fù)電荷減少，這樣便可以降低脂多糖的抵抗作用?？咕目咕鷻C(jī)理的分析較多，主要表現(xiàn)為：其一，對(duì)細(xì)菌呼吸作用進(jìn)行抑制處理，繼而引起線粒體空泡化、腫脹與排列不規(guī)則，導(dǎo)致核膜缺乏界限，引起細(xì)胞內(nèi)容物流出；其二，對(duì)細(xì)胞壁合成進(jìn)行抑制，即抑制細(xì)胞正常生長(zhǎng)，促使細(xì)胞壁穿孔，繼而讓細(xì)胞死亡，但這種方式對(duì)已存在的細(xì)胞壁不發(fā)揮作用[10]；其三，穿模，即對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)或膜進(jìn)行破壞；其四，對(duì)蛋白質(zhì)合成進(jìn)行抑制，即降低蛋白質(zhì)合成，抑制細(xì)胞正常生長(zhǎng)。幾乎所有的抗菌肽都是陽(yáng)離子型，大多具有α螺旋和/或兩親β折迭結(jié)構(gòu)。由于PR-39殺死正在生長(zhǎng)的細(xì)菌比處于非生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)菌要快的多，所以PA-39的殺菌機(jī)理可能是通過(guò)阻斷細(xì)菌蛋白質(zhì)和DNA的合成而殺滅細(xì)菌。因抗菌肽分子α-2螺旋存在著兩親性特征，為此，在抗菌肽分子聚合的過(guò)程中，會(huì)生成一定的離子通道，繼而引起陽(yáng)離子向外流動(dòng)，從而讓細(xì)菌防護(hù)喪失，無(wú)法維持正常的滲透壓，從而促使細(xì)菌死亡。

4 結(jié)論

通過(guò)一系列的試驗(yàn)與分析可知，抗菌肽PR-39特性主要表現(xiàn)為：①抗菌性能顯著，特別是對(duì)鼠傷寒沙門氏菌，有著優(yōu)秀的滅殺效果，對(duì)于金黃色葡萄球菌也存在著一定的抑制性，對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的最低抑菌濃度為10-5mg/ml。②熱穩(wěn)定性較為突出，在高溫環(huán)境中持續(xù)5～15min時(shí)，其抗菌活性仍較為顯著，但隨時(shí)間延長(zhǎng)，活性會(huì)逐漸下降并最終喪失。