淺談非洲豬瘟實驗室檢測的注意事項

陳小麗

(三明市農(nóng)業(yè)局,福建三明 365000)

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，又稱非洲豬瘟疫或疣豬病。臨床以高熱、食物廢絕、皮膚和內(nèi)臟器官出血、高死亡率為特征，沒有特效藥，沒有疫苗，所以一旦發(fā)現(xiàn)必須撲殺并無害化處理。我國將非洲豬瘟列為一類動物疫病，是烈性外來疫病，嚴重危害著全球養(yǎng)豬業(yè)。

非洲豬瘟緣起非洲，1921年，非洲東部的肯尼亞首次確認非洲豬瘟疫情之后，陸續(xù)蔓延至歐洲、南美洲、歐亞交界處的歐洲地區(qū)。2018年8月3日，國家參考實驗室確診沈陽市沈北新區(qū)發(fā)生中國第一例非洲豬瘟疫情。不到一年時間，非洲豬瘟疫情已經(jīng)覆蓋了全中國，農(nóng)業(yè)部也及時采取了各種措施來防控非洲豬瘟。而實驗室檢測成為防控非洲豬瘟疫情中一個非常重要的手段。無論是農(nóng)業(yè)農(nóng)村119公告強調(diào)生豬點對點調(diào)運的非洲豬瘟檢測工作，還是農(nóng)業(yè)農(nóng)村部關(guān)于加強屠宰環(huán)節(jié)非洲豬瘟檢測工作的通知等等都強調(diào)了實驗室非洲豬瘟病原PCR的檢測對非洲豬瘟防控的重要性。

1 非洲豬瘟樣品的采集和送檢

生豬點對點檢測主要是采集生豬的抗凝血。采用裝有抗凝劑的負壓管，前腔靜脈采集5ml的血液，顛倒混勻。如條件允許，最好每份血液樣品采集2管，以便留存充足的備份樣品。豬肉產(chǎn)品的調(diào)運檢測主要采集豬肉組織和豬內(nèi)臟。用采樣杯采集不同部位的豬肉組織和豬脾臟、淋巴結(jié)等內(nèi)臟組織。所有送檢的樣品都必須用病原專用密閉容器密封、固定，置于裝有冷卻用品的容器中迅速送檢。

2 實驗室診斷

非洲豬瘟是外來病，2018年8月第一次在中國確診發(fā)生，而且疫情來勢兇猛，傳播速度驚人。中國動物疫病預(yù)防控制中心、中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所等單位共同組成評價專家，于2018年11月26日至12月19日開展了非洲豬瘟現(xiàn)場快速檢測試劑評價工作。農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳辦公室于2019年1月份公布第一批非洲豬瘟現(xiàn)場快速檢測試劑評價結(jié)果的通知（農(nóng)辦牧（2019）3號）。傳統(tǒng)的病原PCR檢測需要對樣品的核酸進行提取，快速檢測試劑均為免提取試劑盒，不需要對樣品進行核酸提取，只需要對樣品做簡單的處理便可進行擴增檢測，極大的提高了工作效率。

3 實驗室污染的控制措施

生豬點對點調(diào)運實施點對點批批檢，檢測數(shù)多，任務(wù)重。市級實驗室每天平均檢測一千份左右，且實驗室基本每天都在運行。長期大數(shù)量的檢測，嚴重威脅了實驗室的生物安全。很多實驗室經(jīng)過一段時間持續(xù)的檢測后，出現(xiàn)了環(huán)境污染的問題。陰性對照出現(xiàn)特異性的擴增，導(dǎo)致結(jié)果無法判斷。下圖是三明市某縣獸醫(yī)實驗室做非洲豬瘟樣品時的擴增結(jié)果。

從圖片信息可知，陽性對照擴增曲線正常，陰性對照出現(xiàn)擴增曲線，65個未知血樣有14個樣品出現(xiàn)擴增曲線。追溯樣品，來源于3個養(yǎng)殖企業(yè)，目前該養(yǎng)殖企業(yè)的豬各類指標正常，沒有疑似非洲豬瘟的臨床癥狀。結(jié)合實驗室情況，該實驗室最近接收大量的非洲豬瘟生豬血液檢測樣品。由于任務(wù)繁重，人員不足等問題，該實驗室每做完一批非洲豬瘟樣品，僅對實驗室進行簡單的桌面擦拭和紫外消毒。

綜合各類因素，該實驗室先保存好樣品，然后進行一個實驗室的“大掃除”。首先，先把實驗桌面，冰箱，廢物桶等各類實驗廢棄物整理出實驗室進行無害化處理。接著用10%的次氯酸擦拭耗材包裝袋、實驗臺面、熒光定量PCR的放樣孔和其他的臺面。實驗室地面用次氯酸鈉拖洗兩遍。然后長時間的紫外照射實驗操作臺面和其他表面，實驗設(shè)備如加樣器等需高壓消毒處理，最后開通風(fēng)設(shè)備通風(fēng)半天。

為了保證實驗人員的安全及防止有潛在傳染性樣本的散播，樣本處理操作應(yīng)該在生物安全柜中進行。

此圖為實驗室徹底消毒以后，重新對65個樣品進行非洲豬瘟病原PCR檢測，結(jié)果只出現(xiàn)一條陽性對照擴增曲線，陰性對照未出現(xiàn)特異性擴增，65 個未知樣品均未出現(xiàn)特異性擴增。由此可見，實驗室的污染導(dǎo)致了前一次14個樣品的假陽性。

為了避免實驗室的再次污染，日常檢測過程中需要注意幾點。第一、實驗室要進行分區(qū)?；驍U增檢驗實驗室原則上分為三個相對獨立的工作區(qū)域：（1）標本制備區(qū)、（2）反應(yīng)混合物配制區(qū)、（3）擴增產(chǎn)物分析區(qū)。工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品混用。進入各個工作區(qū)域必須嚴格遵循單一方向順序，即只能從標本制備區(qū)、擴增反應(yīng)混合物配制區(qū)至．?dāng)U增及擴增產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。在不同的工作區(qū)域應(yīng)使用不同顏色或有明顯區(qū)別標志的工作服，以便于鑒別。每個區(qū)域都有固定的儀器和設(shè)備，不同局域的物品不得交叉使用。第二、要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應(yīng)避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動?？赏ㄟ^在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應(yīng)混合液的反應(yīng)管，特別是質(zhì)控陽性對照極易污染環(huán)境，需要最后加樣，加樣時特別小心避免氣溶膠產(chǎn)生引起交叉污染。用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒（例如含次氯酸鈉溶液）容器內(nèi)。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料（原始標本、提取中的標本與試劑的混合液等）如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。

非洲豬瘟實驗室檢測已經(jīng)成為防控非洲豬瘟的重要工作之一，實驗室準確的診斷結(jié)果對非洲豬瘟的防控起到了重要的作用。農(nóng)業(yè)部119公告里強調(diào)生豬點對點調(diào)運實行批批檢的政策，加重了各級獸醫(yī)檢測部門的工作量。檢測樣品越多，實驗室就越容易造成污染。為了避免實驗室檢測過程中假陽性或者假陰性的出現(xiàn)，實驗室檢測非洲豬瘟一定要規(guī)范操作。符合農(nóng)業(yè)部相關(guān)的規(guī)定，檢測過程中嚴格按生物安全手冊的相關(guān)規(guī)定操作，保證能夠及時、準確的得出檢測結(jié)果以便指導(dǎo)生產(chǎn)、為疫病的防控提供科學(xué)的依據(jù)。