雞新城疫病毒RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

李鳳琴 葉 超

(西昌學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院,四川西昌 625013)

新城疫病毒屬副黏病毒科，禽腮腺炎病毒屬，禽副黏病毒Ⅰ型，宿主范圍廣泛，給養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生安全帶來了較大的隱患。

新城疫病毒經(jīng)常使用的鑒定方法有雞胚接種、HA和HI試驗、瓊脂擴(kuò)散、免疫熒光技術(shù)（IFA）、免疫組化技術(shù)等，但比較起來，RT-PCR通過體外擴(kuò)增RNA的片段方法，具有特異性強(qiáng)、敏感性高的優(yōu)點(diǎn)，易于操作等優(yōu)勢。

1 方法

試驗于攀西動物疫病檢測與防控省級重點(diǎn)實(shí)驗完成。

以序列GQ338311.1的F蛋白基因序列為模板，使用專業(yè)的引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，上游引物為ATCGGCACAGATAACAGC，下游引物為TCACCACCTTCGGGAC，預(yù)計擴(kuò)增片段為578bp。

用天根生化科技北京有限公司的試劑盒提取總RNA，以弱毒陽性株總RNA為陽性對照，無RNA酶水為陰性對照，反轉(zhuǎn)錄后用25微升體系進(jìn)行擴(kuò)增，優(yōu)化反應(yīng)程序，并對其特異性和靈敏度進(jìn)行檢測。

用建立的RT-PCR方法對采集的100份雞呼吸道分泌物或排泄物樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

建立的RT-PCR方法的最優(yōu)條件為25微升體系，95℃ 5min；95℃ 30S，54.2℃ 45S，72℃ 50S，運(yùn)行35個循環(huán)；72 ℃10min，能在500～750bp之間出現(xiàn)明亮的單一條帶（如圖1）；經(jīng)測序和多病毒RNA混合物RT-PCR發(fā)現(xiàn)該方法特異性強(qiáng)；靈敏為0.005682μg/ml。

圖1 F基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

用建立的方法對采集100份樣品進(jìn)行檢測，其中2份為陽性，陽性率為2%。

3 討論

在本次試驗對100份樣進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有兩份陽性樣品，可能是接種的活疫苗，也有可能是說雞新城疫病毒感染，若要確診，需結(jié)合樣品來源雞場的發(fā)病情況等。雞新城疫病毒傳播迅速，雞發(fā)病后死亡率很高，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病之一，該地區(qū)需要做好雞新城疫的檢測和防控工作。