山茶油脫臭餾出物中角鯊烯的分離純化及對(duì)豬油抗氧化作用的研究

葉虔臻 王 微 董柳青 周琛媛 沈建福

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院1,杭州 310058)(桐廬縣檢驗(yàn)檢測(cè)中心2，杭州 311500)(浙江經(jīng)貿(mào)職業(yè)技術(shù)學(xué)院3，杭州 310018)

角鯊烯(Squalene)是由6 個(gè)異戊二烯連接而成的不飽和三萜類化合物，常溫下呈油狀，有輕微令人愉悅的氣味，具有抗氧化、抗輻射、調(diào)控膽固醇代謝、抑制微生物生長等功效，被廣泛用于化妝品、醫(yī)藥和食品工業(yè)等領(lǐng)域的開發(fā)中[1]。角鯊烯來源廣泛，存在于鯊魚肝臟、植物種籽，以及某些微生物、微藻和人體皮脂中。而目前天然角鯊烯提取主要以植物，如油橄欖、雞矢藤、紅棗等，或植物油及其加工副產(chǎn)物，如皂腳、脫臭餾出物及冬化物等中分離得到[2]。也有研究表明采用工程菌株可大幅提高角鯊烯的制備[3]。

脫臭餾出物是油脂在脫臭環(huán)節(jié)得到的副產(chǎn)物，含有多種生物活性成分，如天然VE、植物甾醇、角鯊烯等[4]。據(jù)李志曉等[5]對(duì)油茶籽油微量營養(yǎng)成分在加工過程中的分析和劉存存[6]對(duì)茶油加工過程中不同階段生物活性成分含量的分析看，脫臭工序是山茶油中角鯊烯損失最多的環(huán)節(jié)，從而使角鯊烯富集于脫臭餾出物中。

皂化分離法能將脫臭餾出物中的大量油脂形成脂肪酸鹽，再通過水洗除去，利用有機(jī)溶劑萃取不皂化物，第一次濃縮富集角鯊烯。通過硅膠進(jìn)一步分離不皂化物，收集洗脫液進(jìn)行檢測(cè)，合并含有角鯊烯的相同成分，純化角鯊烯。相比于超臨界CO2萃取、分子蒸餾法以及酶法提取法，皂化分離法和柱層析法相結(jié)合，操作簡便易行，設(shè)備投入低，維護(hù)少，有較大的分離容量及固定相價(jià)廉且能反復(fù)多次使用等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。主要的缺點(diǎn)是分離時(shí)間太長，可以采用頂部加壓法縮短分離時(shí)間并提高分離效率[7]。

研究對(duì)山茶油脫臭餾出物中角鯊烯的提取工藝進(jìn)行探究，為從山茶油脫臭餾出物中提取天然角鯊烯提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茶油脫臭餾出物；角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品(純度≧98%)；100～200目硅膠、200～300目硅膠；氫氧化鉀、90%乙醇、無水乙醇、正己烷、乙酸乙酯、無水硫酸鈉。

7890B 氣相色譜儀；HP-5色譜柱(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不皂化物的制備

參考GB/T 5535.2—2008并稍作修改[8]。準(zhǔn)確稱取山茶油脫臭餾出物10.00 g于500 mL具塞圓底燒瓶中。加入不同體積、不同濃度的氫氧化鉀-乙醇溶液后，于一定溫度下，反應(yīng)不同時(shí)間。待反應(yīng)完全，從冷凝管頂部加入50 mL蒸餾水后冷卻至室溫，或在流水中加速冷卻。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至250 mL分液漏斗中，加入50 mL正己烷，萃取3次，合并萃取液。分多次用25 mL 10%乙醇水溶液清洗萃取液，直至流出液不使酚酞變紅為止。若清洗過程出現(xiàn)乳濁現(xiàn)象，可添加少量無水乙醇進(jìn)行破乳。將萃取液過無水硫酸鈉脫水后，進(jìn)行旋蒸，得不皂化物，充入氮?dú)庥? ℃冰箱放置，備用。

1.2.2 氣相色譜條件

HP-5毛細(xì)管色譜柱(30.0 m×0.32 mm×0.25 μm)；程序升溫：初始溫度160 ℃，保持2 min；以15 ℃/min上升至280 ℃，保持5 min；再以5 ℃/min上升至300 ℃，保持2 min。檢測(cè)器溫度330 ℃，進(jìn)樣口溫度300 ℃，不分流。

1.2.3 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取20 mg角鯊烯標(biāo)品，用正己烷定容到10 mL，得2 mg/mL角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分別取0.05、0.25、0.50、1.00、7.50 mL儲(chǔ)備液，用正己烷定容至10 mL，得到各濃度。以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，各質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 角鯊烯含量和提取率的測(cè)定

稱取不皂化物0.03 g，正己烷定容至3 mL。吸取1 mL溶液過0.45 μmol/L有機(jī)濾膜，進(jìn)氣相待測(cè)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)及純化實(shí)驗(yàn)

采用皂化法提取山茶油脫臭餾出物中的角鯊烯，對(duì)堿濃度、料液比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取0.075 g不皂化物，采用200～300目硅膠對(duì)不皂化物中的角鯊烯做進(jìn)一步分離純化。采用干法上樣，洗脫劑為正己烷∶乙酸乙酯=100∶1進(jìn)行洗脫，每10 mL為一管進(jìn)行收集，氣相進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算各管角鯊烯含量。

1.2.6 日內(nèi)精密度與日間精密度

在精煉山茶油中添加角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2.1的處理方式，選取10、100、500、1 000 μg/mL 4個(gè)濃度進(jìn)行精密度和回收率的實(shí)驗(yàn)。日內(nèi)精密度每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，日間精密度每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，連續(xù)測(cè)定5 d，取平均值，計(jì)算結(jié)果。

1.2.7 抗氧化性實(shí)驗(yàn)

分別添加不同濃度的角鯊烯純化物和0.02%TBHQ、0.02%BHT和0.01%沒食子酸丙酯于自制豬油中，并采用Rancimat氧化分析儀對(duì)其抗氧化性進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品氣相檢測(cè)如圖1所示，在13.907 min左右出峰。角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，y軸為峰面積，x軸為角鯊烯濃度(μg/mL)，線性回歸方程為：y=2.419 4x-23.43，R2=0.999 6。

圖1 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 反應(yīng)溫度對(duì)角鯊烯含量和提取率的影響

在堿濃度1.0 mol/L，料液比1∶5下，反應(yīng)時(shí)間60 min下，探究反應(yīng)溫度分別為60、70、80、90、100 ℃時(shí)對(duì)角鯊烯含量和提取率的影響。

由圖3a和圖4a可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，角鯊烯含量先上升后下降，在70 ℃時(shí)達(dá)到最高，為30.6%。皂化反應(yīng)是一個(gè)吸熱反應(yīng)，當(dāng)溫度較低時(shí)，反應(yīng)速率慢，皂化不充分，剩余過多的脂肪酸，使得角鯊烯含量減少，提取率較高；隨著溫度上升，反應(yīng)加快。但溫度過高時(shí)，角鯊烯在高溫堿性條件下反應(yīng)時(shí)間過長，會(huì)加劇損失，使得含量和提取率均下降。

圖3 不同因素對(duì)角鯊烯含量的影響

圖4 不同因素對(duì)角鯊烯提取率的影響

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)角鯊烯含量和提取率的影響

在90 ℃，堿濃度1.0 mol/L，料液比1∶5下，探究反應(yīng)時(shí)間分別為30、60、90、120、150 min時(shí)對(duì)角鯊烯含量和提取率的影響。

由圖3b和圖4b可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，在90 min時(shí)含量達(dá)到最高，反應(yīng)時(shí)間加長，角鯊烯的含量和提取率均有較大幅度的下降。這是由于在高溫堿性條件下，時(shí)間越長，角鯊烯被破壞的越多，損失量均增大。而時(shí)間過短，反應(yīng)不充分，提取率雖然較高，但含量較低，增加了后續(xù)純化的難度[9]。

2.2.3 堿濃度對(duì)角鯊烯含量和提取率的影響

在90 ℃，料液比1∶5，反應(yīng)時(shí)間60 min下，探究堿濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L時(shí)對(duì)角鯊烯含量和提取率的影響。

由圖3c和圖4c可知，隨著堿濃度的升高，角鯊烯含量呈上升趨勢(shì)，在1.5 mol/L時(shí)達(dá)到最高；提取率則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。這是由于在低濃度時(shí)，皂化不完全，殘留過多的脂肪酸，水洗不能去除，導(dǎo)致角鯊烯在不皂化物中的含量過低；隨著濃度的升高，皂化更加徹底，反應(yīng)更完全，角鯊烯得到富集，但過量的堿也可能導(dǎo)致角鯊烯被破壞，因此提取率下降[10]。

2.2.4 料液比對(duì)角鯊烯含量和提取率的影響

在90 ℃，堿濃度1.0 mol/L，反應(yīng)時(shí)間60 min下，探究料液比分別為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9時(shí)對(duì)角鯊烯含量和提取率的影響。

由圖3d和圖4d可知，隨著料液比增加，角鯊烯含量先上升后下降，提取率呈下降趨勢(shì)。在料液比1∶7左右時(shí)，脫臭餾出物與堿溶液反應(yīng)較完全，因此角鯊烯含量高。但隨著堿液量的增加，角鯊烯在高溫下被破壞的量也隨之增加，從而提取率有所下降。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

以角鯊烯含量和提取率為指標(biāo)，選取堿濃度、料液比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度4個(gè)因素,每個(gè)因素3水平作為變量，設(shè)計(jì)L9(34)因素水平表，見表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 角鯊烯含量和提取率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

從表2可知，經(jīng)正交優(yōu)化后，角鯊烯的含量和提取率均大幅提升，含量除第一組外均達(dá)到30%及以上，提取率除第二、三組外，也都達(dá)到了60%以上。由于角鯊烯含量相差不大，選取提取率進(jìn)行數(shù)據(jù)極差分析。通過極差分析結(jié)果來看，影響角鯊烯提取率的因素主次順序分別為A>C>D>B，即堿濃度>反應(yīng)溫度>反應(yīng)時(shí)間>料液比。綜合分析可知，實(shí)驗(yàn)最優(yōu)方案為A2B2C1D3，即堿濃度1.3 mol/L,料液比1∶6，反應(yīng)時(shí)間60 min，反應(yīng)溫度90 ℃，并在此條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)，含量和提取率分別為35.22%和81.97%。

2.4 日內(nèi)精密度及日間精密度

角鯊烯的加標(biāo)回收率及日內(nèi)精密度與日間精密度結(jié)果見表3和表4。

表3 山茶油樣品中角鯊烯的加標(biāo)回收率及日內(nèi)精密度

表4 山茶油樣品中角鯊烯的加標(biāo)回收率及日間精密度

從表3可得，日內(nèi)精密度檢測(cè)中加標(biāo)回收率在98.75%～102.39%之間，RSD值在1.60～7.73之間；從表4可得，日間精密度檢測(cè)中加標(biāo)回收率在98.45%～102.55%，RSD值介于4.00～8.99，兩者都符合RSD<10%的規(guī)定。

2.5 角鯊烯分離純化

硅膠柱層析進(jìn)一步純化不皂化物，獲得角鯊烯純品。純化結(jié)果如圖5所示，氣相色譜檢測(cè)(第23管)如圖6所示。

圖5 硅膠柱分離不皂化物中角鯊烯

圖6 純化后角鯊烯氣相色譜檢測(cè)(第23管)

從圖6可知，在第18管時(shí)，角鯊烯開始富集，并在第23管的時(shí)候達(dá)到最高值，之后逐漸減少，到第35管左右含量明顯減少。圖5可以看到經(jīng)硅膠分離后，角鯊烯的純度得到極大的提升，從第20管到第34管，角鯊烯的出峰圖像均與第23管相似。因此，通過200～300目硅膠純化不皂化物中的角鯊烯，可得到有效富集，收率達(dá)到94.5%，純度為90%。

2.6 Rancimat 氧化分析實(shí)驗(yàn)

在130 ℃下，比較了不同濃度角鯊烯提取物和不同抗氧化劑及復(fù)配后的抗氧化性效果，結(jié)果見圖7、圖8。

注：與豬油組比較，不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。圖7 不同濃度角鯊烯對(duì)豬油的抗氧化作用

注：A：豬油 0.02%角鯊烯純化物；B： 0.02%BHT 0.02%角鯊烯純化物+0.02%BHT；C： 0.01%PG 0.02%角鯊烯純化物+0.01%PG；D：0.02%TBHQ 0.02%角鯊烯純化物+0.02%TBHQ。*表示該組相比較于組內(nèi)有顯著性差異(P<0.05)。圖8 抗氧化劑復(fù)配對(duì)豬油的抗氧化作用

從圖7可知，添加了0.02%角鯊烯純化物的豬油誘導(dǎo)時(shí)間顯著提升，表明該濃度下的角鯊烯可有效增強(qiáng)油脂的抗氧化性(P<0.05)，但在高濃度時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間反而降低，可能是角鯊烯自身被氧化后的產(chǎn)物加劇了油脂的氧化；在圖8中，抗氧化劑均能顯著提高豬油的抗氧化性(P<0.05)，而TBHQ的作用效果最佳，BHA和PG次之且作用效果相當(dāng)。不過當(dāng)角鯊烯提取物與各抗氧化劑復(fù)配使用時(shí)，PG與角鯊烯的復(fù)配有顯著的增益效果(P<0.05)，而其余的復(fù)配效果不顯著(P>0.05)。

3 結(jié)論

山茶油含有豐富的、有利于人體健康的代謝產(chǎn)物，如植物甾醇、維生素E、角鯊烯等，但脫臭環(huán)節(jié)真空、高溫的條件，使得這些代謝產(chǎn)物損失嚴(yán)重。本研究結(jié)合皂化法和柱層析法，從山茶油的脫臭餾出物中富集和純化角鯊烯。此方法不僅降低了生產(chǎn)成本，同時(shí)也提高了天然產(chǎn)物的利用率，避免了企業(yè)在設(shè)備上的昂貴投入和維護(hù)。最優(yōu)提取條件為堿濃度1.3 mol/L，料液比1∶6，反應(yīng)時(shí)間60 min，反應(yīng)溫度90 ℃。在此條件下角鯊烯質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35.22%，提取率為81.97%，實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值接近。通過硅膠柱層析進(jìn)一步分離純化角鯊烯，收率為94.5%，純度為90%。此外，對(duì)其抗氧化性進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)0.02%的提取物有較好的抗氧化性，但在高濃度時(shí)有促氧化的作用。通過協(xié)同作用可促進(jìn)其他抗氧化劑的效果，因此可以作為油脂中其他天然或合成抗氧化劑的增效劑復(fù)合使用。