多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中RAD18的表達(dá)及與放射抵抗的關(guān)系

周亞燕 李子煌 李壯玲 方敏捷 李先明

【摘要】 目的 研究RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）放射抵抗的相關(guān)性。方法 80例放射治療的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者為研究對(duì)象， 根據(jù)是否復(fù)發(fā)分為觀察組（復(fù)發(fā)）和對(duì)照組（原發(fā)）， 各40例。將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172分別轉(zhuǎn)染空白和裝有RAD18的質(zhì)粒載體， 應(yīng)用克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)相同劑量射線照射后兩組細(xì)胞增殖情況， 采用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）方法檢測(cè)原發(fā)性及放射性粒子近距離治療后復(fù)發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中RAD18信使核糖核酸（mRNA）的表達(dá)情況， 并分析RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗的相關(guān)性。結(jié)果 人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172中RAD18蛋白表達(dá)與正常人星形膠質(zhì)細(xì)胞（NHAs）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。轉(zhuǎn)染RAD18質(zhì)粒的A172細(xì)胞中RAD18蛋白表達(dá)及γ射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)量分別為（0.91±0.09）和（157.25±15.13）， 顯著高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的A172細(xì)胞的（0.22±0.02）和（55.24±5.31）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。復(fù)發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（觀察組）的RAD18蛋白表達(dá)為（14.12±1.21）， 顯著高于原發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（對(duì)照組）的（7.18±0.71）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)直線相關(guān)分析， RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗呈正相關(guān)（r=0.621， P<0.05）。結(jié)論 RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗有關(guān)， RAD18的細(xì)胞修復(fù)能力會(huì)導(dǎo)致放射抵抗的發(fā)生， 臨床在放射治療時(shí)應(yīng)針對(duì)RAD18進(jìn)行抑制處理。

【關(guān)鍵詞】 多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤;RAD18;放射抵抗;相關(guān)性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.19.036

星形細(xì)胞腫瘤中惡性程度最高的是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤， 多見于成年人， 表現(xiàn)為毛細(xì)血管明顯增生， 內(nèi)皮細(xì)胞增生、腫大， 可導(dǎo)致管腔閉塞和血栓形成， 腫瘤發(fā)展迅速， 預(yù)后差， 患者多在2年內(nèi)死亡[1， 2]。近年來， 隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷提升， 其放射治療水平也呈上升趨勢(shì)， 精準(zhǔn)度更強(qiáng)， 療效更佳。但即使如此， 臨床還是有相當(dāng)一部分患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)， 對(duì)放射治療出現(xiàn)抵抗， 臨床已經(jīng)證實(shí)其復(fù)發(fā)的原因與放射抵抗有關(guān)[3， 4]。因此本院展開研究， 探討RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗的相關(guān)性， 現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2017年10月～2018年10月收治的80例放射治療的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者為研究對(duì)象， 患者均經(jīng)臨床診斷及檢查確診為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤， 經(jīng)影像學(xué)檢查及手術(shù)證實(shí)是否復(fù)發(fā)， 患者均知情同意并排除不愿參加本次研究者及合并嚴(yán)重精神障礙者?；颊吒鶕?jù)是否復(fù)發(fā)分為觀察組（復(fù)發(fā)）和對(duì)照組（原發(fā)）， 各40例。觀察組男22例、女18例;年齡35～61歲， 平均年齡（48.82±4.61）歲;發(fā)病部位：額葉27例、頂枕葉12例、顳葉1例。對(duì)照組男19例、女21例;年齡36～62歲， 平均年齡（49.57±4.53）歲;發(fā)病部位：額葉26例、頂枕葉13例、顳葉1例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 分別收集NHAs及膠質(zhì)瘤細(xì)胞， 利用冰磷酸鹽對(duì)其漂洗2次， 加入RIPA裂解液后于5 min冰上靜置。展開超聲破碎細(xì)胞， 吸入預(yù)冷的1.5 ml EP管中， 總共10～20次，?1～2 s/次， 5～10 s間隔后進(jìn)行下一次。隨后將其離心30 min， 轉(zhuǎn)速選擇最高。應(yīng)用Bradford試劑盒對(duì)RAD18蛋白濃度展開檢測(cè)。取等濃度蛋白樣品置于碧云天生物技術(shù)研究所提供的12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠中電泳， 跑膠1.5 h， 分離膠部分90～100 V， 積層膠部分50～60 V。然后將膠轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。膜上加入1︰250稀釋的鼠抗人RAD18一抗， 于室溫下2 h孵育。隨后對(duì)其進(jìn)行15 min的洗膜， 總共3次。將經(jīng)1︰1000稀釋的羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗加入其中， 再次孵育， 與之前相比， 溫度相同， 時(shí)間由原來2 h減至1 h， 洗膜次數(shù)一致。觀察信號(hào)時(shí)使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)。參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書， 對(duì)有抗性的細(xì)胞進(jìn)行篩選。

將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172分別轉(zhuǎn)染空白和裝有RAD18的質(zhì)粒載體， 應(yīng)用克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)經(jīng)相同劑量射線照射后兩組細(xì)胞增殖情況， 用Western blot檢測(cè)兩組RAD18變化。采用qRT-PCR方法檢測(cè)原發(fā)性及放射性粒子近距離治療后復(fù)發(fā)性GBM樣本中RAD18 mRNA的表達(dá)情況， 分析RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗的相關(guān)性。

1. 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn);RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗采用相關(guān)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172中RAD18蛋白表達(dá)為（0.17±0.03）， 與NHAs的（0.18±0.02）比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.754， P>0.05）。轉(zhuǎn)染RAD18質(zhì)粒的A172細(xì)胞中RAD18蛋白表達(dá)及γ射線照射后細(xì)胞克隆形成數(shù)量分別為（0.91±0.09）和（157.25±15.13）， 顯著高于轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的A172細(xì)胞的（0.22±0.02）和（55.24±5.31）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。復(fù)發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（觀察組）的RAD18 mRNA表達(dá)為（14.12±1.21）， 顯著高于原發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（對(duì)照組）的（7.18±0.71）， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.286， P<0.05）。經(jīng)直線相關(guān)分析， RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗呈正相關(guān)（r=0.621， P<0.05）。

3 討論

RAD18參與多種蛋白酶的表達(dá)， 是一種泛素蛋白酶體系統(tǒng)的重要成分， 不僅能維護(hù)細(xì)胞正常活性， 還能對(duì)遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用[2]。在放射治療時(shí)， RAD18會(huì)因DNA損傷被招募至DNA損傷處， 利用RAD18對(duì)DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力， 與泛素結(jié)合酶RAD6結(jié)合形成二聚體， 從而抑制細(xì)胞凋亡， 促使增殖細(xì)胞核抗原發(fā)生單泛素化， 在單泛素化后會(huì)向下游的效應(yīng)器發(fā)出信號(hào)， 以此招募DNA聚合酶， 達(dá)到修復(fù)的目的。除此以外， RAD18不僅對(duì)跨損傷DNA合成有調(diào)節(jié)作用， 對(duì)氧化損傷也能起到修復(fù)作用。相關(guān)研究表明[3-5]， RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗有關(guān)。本研究顯示RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗有關(guān)， RAD18的細(xì)胞修復(fù)能力會(huì)導(dǎo)致放射抵抗的發(fā)生， 與文獻(xiàn)[6， 7]報(bào)道基本一致。復(fù)發(fā)性多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的RAD18 mRNA表達(dá)量顯著高于原發(fā)性， 其原因可能在于當(dāng)患者細(xì)胞DNA受到放射治療引起損傷后， RAD18會(huì)對(duì)損傷起到修復(fù)作用， 導(dǎo)致DNA的修復(fù)能力得到極大提升， 這也是實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示RAD18升高的原因， 在此情況下， 能減少腫瘤細(xì)胞， 導(dǎo)致多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者產(chǎn)生放射抵抗， 因此， 證實(shí)了本次研究結(jié)果， 即RAD18與多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤放射抵抗存在相關(guān)性。根據(jù)此結(jié)果， 臨床若以RAD18為靶點(diǎn)， 應(yīng)用RNA干擾技術(shù)特異性抑制RAD18表達(dá)， 或許能夠緩解多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者產(chǎn)生放射抵抗， 為放射治療提高療效。

綜上所述， 放射治療會(huì)導(dǎo)致DNA損傷， RAD18會(huì)修復(fù)此損傷， 引起患者放射抵抗， 臨床在治療時(shí)， 可采用RNA干擾技術(shù)， 專門針對(duì)RAD18進(jìn)行抑制， 減少RAD18在放射過程中的作用， 提升治療效果。

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[收稿日期：2019-02-11]