芒果品種遺傳多樣性及其親緣關(guān)系研究

韋再行　陸英　秦田偉　李賢宇

芒果材料的基因組遺傳復(fù)雜;利用ISSR分子標(biāo)記，進(jìn)行野生芒果品種資源親緣關(guān)系的研究，為我國部分野生芒果遺傳多樣性研究提供基礎(chǔ)，為野生芒果種質(zhì)親緣關(guān)系分析，遺傳作圖，分子標(biāo)記輔助育種等方面提供參考。

芒果在我國的栽培歷史悠久，種植由于起源循環(huán)途徑多樣，地方品種沒有確切的科學(xué)名稱，造成同物異名現(xiàn)象普遍，需建立快速高效的芒果種質(zhì)資源鑒定技術(shù)工具、研究芒果種質(zhì)資源的遺傳多樣性，有助于子代與親本的快速鑒別。

目前，國內(nèi)外學(xué)者針對(duì)我國芒果主栽品種指紋圖譜構(gòu)建研究較少，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)30份芒果主栽品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期為我國芒果主栽品種育種實(shí)踐及知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等提供參考依據(jù)，為芒果品種的DUS測(cè)試奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增標(biāo)記是由蒙特利大學(xué)Zietkiewicz等提出的新型分子標(biāo)記技術(shù)，真核生物基因組中廣泛存在由1-4個(gè)堿基對(duì)組成的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，ISRR分子標(biāo)記是用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在PCR反應(yīng)中，錨定引物可引起特定位點(diǎn)退火，用于ISSR-PCR擴(kuò)增的引物通常為16-18個(gè)堿基序列，擴(kuò)增的Inter-SSR區(qū)域多個(gè)條帶可通過聚丙烯苔氨凝膠電泳得以分辨。

運(yùn)用ISRR標(biāo)記技術(shù)時(shí)，篩選出多態(tài)性強(qiáng)的引物是ISSR技術(shù)的關(guān)鍵，引物的總長度為15-24bp，用于ISRR的引物常為5或3端加錨的二核普酸，四核普酸重復(fù)序列。植物基因組中最多的SRR是二核昔酸重復(fù)序列，要保證引物的Tm值靠近退火溫度，引物最好有錨定堿基，使定位更準(zhǔn)確，數(shù)據(jù)更可靠。

目前ISRR技術(shù)在果樹遺傳育種上的應(yīng)用主要包括種質(zhì)資源鑒定，指紋圖譜的構(gòu)建，果樹的進(jìn)化與奇緣關(guān)系及目標(biāo)基因定位方面。ISRR標(biāo)記技術(shù)對(duì)RCR反應(yīng)的敏感度比RAPD低，實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化非常必要，ISRR引物含有重復(fù)序列，基因組內(nèi)靶序列在DNA復(fù)制中存在不均交換現(xiàn)象，引起引物結(jié)合點(diǎn)之間的片斷長度差異。

ISRR以其設(shè)備重復(fù)性高，多態(tài)性豐富的特點(diǎn)在果樹系統(tǒng)分類方面發(fā)揮重大作用，ISRR分子標(biāo)記技術(shù)使利用分子標(biāo)記預(yù)測(cè)成為可能，通過對(duì)遺傳標(biāo)記的間接選擇可分辨某些不易區(qū)分的形狀，ISRR分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于多種果樹上，解決過去制約果樹育種周期長的問題，在果樹育種研究方面具有廣闊的前景。

1、芒果品種遺傳多樣性實(shí)驗(yàn)

①實(shí)驗(yàn)方法

芒果主栽品種葉片材料由農(nóng)林科學(xué)院熱帶作物品種資源研究中心提供，基因組DNA提取，采集實(shí)驗(yàn)材料幼葉，將濃度統(tǒng)一調(diào)整至20ng/μL保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)已開發(fā)SRR標(biāo)記，合成115對(duì)SSR引物，以海頓，緬甸球芒為主栽品種為材料進(jìn)行引物篩選，確定條帶清晰的多態(tài)性SSR標(biāo)記用于遺傳多樣性分析。PCR反映體系20.0μL包括10×Buffer2.0μL，以超純水補(bǔ)充至20μL，94℃預(yù)變形5min，72℃1min，72℃延伸5min，擴(kuò)增產(chǎn)物用6%變性聚合丙烯酰胺凝膠分離電泳緩沖液為1×TBE，電泳后銀染顯色。

用Popgene計(jì)算Shannons多態(tài)指數(shù)，計(jì)算Dice遺傳相似系數(shù)，用Powermaket軟件計(jì)算SSR位點(diǎn)的多態(tài)性信息量。根據(jù)每對(duì)SSR引物擴(kuò)增的所有差異譜帶，純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/X，雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，小片段在前，根據(jù)指紋圖譜出現(xiàn)的概率共識(shí)P=1/2n，統(tǒng)計(jì)圖譜的置信概率。

②實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用改良的CTAB法可有效提取總DNA，經(jīng)瓊脂糖電泳監(jiān)測(cè)，基因組DNA條帶清晰，說明提取的DNA質(zhì)量較好，對(duì)提取的DNA樣品進(jìn)行監(jiān)測(cè)，OD260/OD280可用于SSR引物的篩選。

利用115對(duì)引物對(duì)5份芒果資源進(jìn)行引物篩選，利用64對(duì)引物組合對(duì)30份芒果種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)SSR擴(kuò)增結(jié)果，平均Shannons多態(tài)性指數(shù)為1.00，64對(duì)引物PIC變幅為0.07-0.77，引物M46的多態(tài)性對(duì)稿，所有引物中的PIC小于0.20的有4個(gè)。

利用NTsys軟件進(jìn)行聚類分析，將30份芒果材料分為四類群體，第一類包括14分材料，第二類包括11分材料，第三類包括4分材料，第四類有一個(gè)品牌馬切蘇。

選出7對(duì)SSR引物構(gòu)建了數(shù)字化指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)引物產(chǎn)生標(biāo)記信息可完全區(qū)分芒果品種，引物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)為58，芒果品種中可能存在2個(gè)品種的電泳圖譜完全相同。

2總結(jié)

SSR分子標(biāo)記由于具有共顯性等優(yōu)點(diǎn)，已成為作物遺傳多樣性分析的主要方法，廣泛應(yīng)用于各種作物上，在芒果種質(zhì)資源遺傳多樣性研究上相對(duì)落后，使用SSR標(biāo)記數(shù)目一般少于40對(duì)，本文從115對(duì)SSR標(biāo)記中篩選獲得64對(duì)多態(tài)性SSR標(biāo)記。

由于我國芒果資源自國外不同地方引進(jìn)，從國內(nèi)不同地方收集的資源不能按地域性聚集。30份芒果主栽品種第一類包含14份材料，說明品種與其他品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。第二類根據(jù)國外引進(jìn)材料育成品種，第三類材料僅有4分品種，說明同一單位育出的芒果品種可能是同一父母本，鷹嘴芒與象牙22聚類結(jié)果顯示器親緣關(guān)系較近，其遺傳組分與鷹嘴芒更相似。

目前，我國芒果生產(chǎn)中存在同物異名的現(xiàn)象，利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)苗真實(shí)性進(jìn)行鑒定不受時(shí)空的限制，能最大幅度提高品種鑒定的準(zhǔn)確度，我國將DNA指紋圖譜鑒定作為品種質(zhì)量監(jiān)控的重要措施，本文建立30份中國芒果主栽品種數(shù)字指紋圖譜。

由于芒果遺傳多樣性豐富，建立了不同芒果品種的DNA指紋圖譜，利用構(gòu)建的SSR分子標(biāo)記指紋圖譜，可在芒果育種中合理選配親本，加快遺傳改良進(jìn)程，為芒果品種群劃分提供分子遺傳學(xué)依據(jù)。

（作者單位：1.531500廣西壯族自治區(qū)田東縣義圩鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心;2.533000廣西壯族自治區(qū)百色市芒果研究院;3.545400廣西壯族自治區(qū)融安縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心;4.530000廣西壯族自治區(qū)土壤肥料工作站）