葫蘆素B靶向抑制STAT3抗吉非替尼耐藥非小細(xì)胞肺癌的研究

丘韶校 曾超朋 何臣 李元廣 宋衛(wèi)東

[摘要] 目的 探討葫蘆素B通過抑制STAT3信號活化，從而拮抗EGFR T790M突變介導(dǎo)的NSCLC吉非替尼耐藥的機制。 方法 利用不同濃度的葫蘆素B作用于PC-9/GR細(xì)胞的不同時期，用CCK-8法測定細(xì)胞的增殖抑制、PI染色法檢測細(xì)胞的周期、Annexin-v/7-AAD雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞的凋亡，檢測不同濃度以及作用時間的葫蘆素B對PC-9/GR細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。 結(jié)果 葫蘆素B能夠顯著抑制PC-9/GR細(xì)胞增殖以及對細(xì)胞周期的G2/M期有明顯阻滯作用，而且呈濃度依賴，隨著濃度增加，其增殖抑制作用和阻滯活性也增高，同時觀察到PC-9/GR細(xì)胞分別加入10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L三種濃度的葫蘆素B作用后，抑制了p-Jak2、p-STAT3的表達(dá)，且這種抑制呈濃度依賴性，但不影響p-EGFR的激活以及總EGFR、Jak2、STAT3的表達(dá)。 結(jié)論 葫蘆素B能夠抑制吉非替尼耐藥NSCLC中異常激活的STAT3信號途徑，這種抑制具有選擇性，從而誘導(dǎo)吉非替尼耐藥NSCLC的凋亡。

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌;吉非替尼;耐藥性;葫蘆素B

[中圖分類號] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）16-0034-04

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of cucurbitacin B inhibiting STAT3 signaling to antagonize EGFR T790M mutation-mediated gefitinib resistance to NSCLC. Methods Different concentrations of cucurbitacin B were applied to different periods of PC-9/GR cells. Cell proliferation inhibition was measured by CCK-8 method， cell cycle was detected by PI staining， and cell apoptosis was detected by Annexin-v/7-AAD double labeling method. The effects of cucurbitacin B on the proliferation inhibition， cell cycle blockage and cell apoptosis induction of PC-9/GR cells were detected at different concentrations and effecting times. Results Cucurbitacin B could significantly inhibit the proliferation of PC-9/GR cells and significantly blocked the G2/M phase of the cell cycle， and was concentration dependent. As the concentration increased， its effects of proliferation inhibition and blockage also increased. At the same time， PC-9/GR cells were observed to inhibit the expression of p-Jak2 and p-STAT3 by adding cucurbitacin B at 10 nmol/L， 100 nmol/L and 1000 nmol/L， respectively. Moreover， this inhibition was concentration-dependent， but did not affect the activation of p-EGFR and the expression of total EGFR， Jak2， and STAT3. Conclusion Cucurbitacin B can inhibit the abnormally activated STAT3 signaling pathway in gefitinib-resistant NSCLC. This inhibition is selective， thereby inducing the apoptosis of gefitinib-resistant NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer; Gefitinib; Drug resistance; Cucurbitacin B

肺癌的早期診斷困難，70%的肺癌患者發(fā)現(xiàn)時已屬中晚期，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占其中絕大多數(shù)，比例達(dá)80%以上，但由于NSCLC對放化療不敏感，NSCLC的治療仍然是目前臨床面臨的難題，雖然有手術(shù)、化放療及中成藥等綜合治療，NSCLC的治療仍存在許多問題，5年生存率仍少于10%[1]。目前，靶向藥物已被廣泛應(yīng)用于各種腫瘤患者的治療，療效顯著，吉非替尼作為NSCLC的靶向藥物，目前應(yīng)用廣泛，是針對表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的靶向藥物，主要用于治療晚期NSCLC患者，對帶有EGFR 激活突變的NSCLC患者有顯著的治療效果，且副作用少，相對于傳統(tǒng)化放療具有明顯的優(yōu)勢[2]。但目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)初期對吉非替尼治療有效的NSCLC患者，在經(jīng)過10個月左右的緩解期后，出現(xiàn)病灶進(jìn)展，出現(xiàn)獲得性耐藥[3]，因此，明確吉非替尼耐藥性產(chǎn)生的機制以及研究新方法對抗吉非替尼耐藥已經(jīng)成為NSCLC治療領(lǐng)域中的熱門。

關(guān)于NSCLC治療中吉非替尼如何產(chǎn)生獲得性耐藥，其分子機制目前仍存在爭議，尚未完全明確，目前普遍的觀點認(rèn)為，是由于基因的二次突變和原癌基因的擴(kuò)增引起，其分子機制是EGFR基因外顯子20的T790M二次突變（約50%）和原癌基因c-MET的擴(kuò)增，導(dǎo)致正常情況下EGFR酪氨酸激酶結(jié)合區(qū)ATP結(jié)合外，還阻止吉非替尼和酪氨酸激酶的進(jìn)一步結(jié)合，導(dǎo)致EGFR蛋白激酶的持續(xù)激活，重新激活先前阻斷的磷酸化信號途徑，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的持續(xù)生長，從而產(chǎn)生耐藥[4-7]。但是，不管是基因二次突變，還是原癌基因擴(kuò)增介導(dǎo)的獲得性耐藥，維持腫瘤的存活均需要EGFR及其下游MAPK/ERK或PI3K/AKT信號分子的持續(xù)活化，因此，近年來國內(nèi)外許多學(xué)者針對以上耐藥機制進(jìn)行了有益的治療探索。本研究旨在闡明利用葫蘆素B的信號分子導(dǎo)向作用，葫蘆素B能夠選擇性抑制吉非替尼耐藥NSCLC中持續(xù)活化的轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（STAT3）信號途徑，從而誘導(dǎo)吉非替尼耐藥NSCLC細(xì)胞的凋亡，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司），葫蘆素B（美國Sigma公司），細(xì)胞培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板（美國Corning公司），抗人總EGFR抗體、磷酸化抗人EGFR抗體、抗人總Stat3抗體、磷酸化抗人Stat3抗體、預(yù)染SDS-PAGE低分子量Marker、發(fā)光Marker、山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（美國Cell Signaling公司），BCA蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司），牛血清白蛋白（BSA）（杭州天象人公司）。

1.2檢測方法[8]

1.2.1 細(xì)胞增殖抑制采用CCK-8法檢測? 對數(shù)生長期PC-9/GR細(xì)胞，胰酶消化，離心，取96孔培養(yǎng)板，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液，置37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱靜置培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度的葫蘆素B（終濃度為10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L）的新鮮培養(yǎng)基，每一濃度重復(fù)3孔，設(shè)試劑對照組及細(xì)胞對照組，置37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱靜置培養(yǎng);72 h后每孔加CCK-8溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀上450 nm處測OD值，按下述公式：存活率=（A實驗組-試劑對照組）/（A細(xì)胞對照組-試制對照組）×100%，計算每一濃度的存活率。

1.2.2 細(xì)胞周期檢測采用PI染色法檢測? 對數(shù)生長期PC-9/GR細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、離心，按5×105/mL細(xì)胞濃度制成細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液接種至6孔培養(yǎng)板，每孔12 mL細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng);培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基，加入不同濃度的葫蘆素B至終濃度分別為10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L及DMSO對照，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h;經(jīng)離心、調(diào)整，最后避光染色30 min后流式細(xì)胞儀上機檢測，Multicycle軟件進(jìn)行DNA分析。

1.2.3 磷酸化和總EGFR、B-Actin、Stat3及Jak2的表達(dá)采用Westen-blot（免疫印跡法）檢測? 對數(shù)生長期PC-9/GR細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化、離心，按5×105/mL細(xì)胞濃度制成細(xì)胞懸液，取10 mL細(xì)胞懸液接種至10 cm培養(yǎng)皿中。待細(xì)胞生長至80%匯合時，換用含10 nmol/L、100 nmol/L、1000 nmol/L葫蘆素B及DMSO對照的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，分別提取總蛋白進(jìn)行免疫印跡檢測磷酸化及總EGFR、Jak2、Stat3、B-Actin的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗及方差分析，并使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)的進(jìn)一步分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各種濃度葫蘆素B對PC-9/GR細(xì)胞作用不同時間后檢測細(xì)胞增殖抑制率和G2/M期阻滯率

葫蘆素B能夠?qū)C-9/GR細(xì)胞增殖和G2/M期細(xì)胞周期阻滯起明顯抑制作用，且這種抑制作用呈濃度依賴性，隨著濃度的增加，其對細(xì)胞周期阻滯活性、細(xì)胞增殖抑制也出現(xiàn)相應(yīng)增強，各組間對比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;當(dāng)葫蘆素B濃度高于100 nmol/L時，葫蘆素B對PC-9/GR細(xì)胞的增殖抑制和細(xì)胞周期阻滯活性具有時間依賴性。隨著時間的延長，其抑制以及阻滯活性明顯加強，各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;其中用1000 nmol/L濃度的葫蘆素B處理48 h后，觀察到葫蘆素B對PC-9/GR細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期阻滯活性的抑制作用最強。細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞周期阻滯分別為（65.56±3.98）%和（57.34±3.92）%。見表1、2。

2.2 PC-9/GR細(xì)胞分別經(jīng)三種濃度的葫蘆素B作用及作用6 h后分析

采用Western blot法檢測葫蘆素B不同濃度對PC-9/GR細(xì)胞EGFR、Jak2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)的影響，PC-9/GR細(xì)胞分別經(jīng)三種濃度的葫蘆素B（分別為10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L）作用后，隨著葫蘆素B濃度的增加，其抑制p-Jak2、p-STAT3的表達(dá)作用越強，但對p-EGFR激活以及總EGFR、Jak2、STAT3的表達(dá)影響不明顯（圖1）。

PC-9/GR細(xì)胞分別經(jīng)三種濃度葫蘆素B（分別為10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L）作用6 h后，檢測EGFR、Jak2/STAT3（Westen-blot法）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子激活的程度，觀察到P-Jak2、p-STAT3表達(dá)是無活性的，并且具有濃度依賴性，而p-EGFR是持續(xù)的。

3 討論

葫蘆素B（cucurbitacin B）是從葫蘆科等植物中取得的，經(jīng)過提取分離，已被證實具有多種藥理活性。上世紀(jì)，我國已經(jīng)研發(fā)出葫蘆素B含量為60%的葫蘆素B/E單體復(fù)合制劑，其廣泛用于肝炎以及原發(fā)性肝癌的治療，其抗癌作用及其機制是近年研究的熱點[9-10]。近幾年國內(nèi)許多外學(xué)者對葫蘆素B 的抗各種腫瘤的作用進(jìn)行了較全面的研究，發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用是因為其對STAT3 轉(zhuǎn)錄因子的活化有較強的抑制作用，且與抑制STAT3 轉(zhuǎn)錄因子的持續(xù)活化有關(guān)[11-13]。Zhang M等[14]研究表明，葫蘆素B能夠抑制A549肺癌細(xì)胞中STAT3轉(zhuǎn)錄因子的活化，而且這種抑制作用呈濃度依賴性，從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡。

STAT3作為癌基因，在各種類型的細(xì)胞及組織中有廣泛表達(dá)，其在腫瘤細(xì)胞的增殖、生長、凋亡及腫瘤免疫微環(huán)境異常等的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵的作用，其在惡性腫瘤細(xì)胞中持續(xù)活化。目前發(fā)現(xiàn)，由于STAT3的活化水平在EGFR 突變的NSCLC 細(xì)胞中異常增高，因此，在EGFR 體細(xì)胞突變的NSCLC中，STAT3 的活化被認(rèn)為是癌癥發(fā)生的必要條件[15]。Choi S等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在多種人體實體瘤中，由于STAT3 的持續(xù)激活，細(xì)胞凋亡抑制因子（包括Bcl-2、Bcl-xl、MCL-1）和細(xì)胞周期調(diào)控因子（包括C-myc、CyclinD1 等）的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，從而刺激腫瘤細(xì)胞的增殖、阻礙凋亡，并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥。國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)[17-19]，通過動物實驗抑制STAT3 的活化，惡性黑素瘤、胃癌及卵巢癌等對化療藥物的敏感性明顯提高。此外，有研究發(fā)現(xiàn)[20-21]，在各種耐藥癌細(xì)胞中檢測到STAT3 mRNA 水平在對化療藥物較敏感細(xì)胞中明顯增高。Cao W等[22]研究證實，高三尖杉酯堿能夠抑制IL-6/STAT3信號路徑，STAT3的活化受到抑制，利用高三尖杉酯堿能夠抑制吉非替尼耐藥NCI-H1975細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡。Gao SP等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在STAT3的激活啟動時期發(fā)揮著關(guān)鍵的作用可能是EGFR的活化突變，而EGFR活化突變的NSCLC STAT3持續(xù)活化的主要調(diào)節(jié)因素是IL-6/STAT3/IL6自分泌/旁分泌環(huán)。但是，目前關(guān)于NSCLC中STAT3水平與吉非替尼耐藥關(guān)聯(lián)性的分子機制，我們的認(rèn)識并不充分。

本研究顯示，葫蘆素B體外實驗?zāi)軌蛞种芇C-9/GR細(xì)胞的增殖并阻滯細(xì)胞周期G2/M期，這種作用呈濃度及時間依賴性，其機制與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受抑制密切相關(guān)，其分子機制是由于EGFR活化突變非依賴性的Jak2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受到抑制;因此我們認(rèn)為葫蘆素B能夠抑制吉非替尼耐藥的NSCLC中異常激活的STAT3信號途徑，從而誘導(dǎo)吉非替尼耐藥NSCLC的凋亡，這種抑制具有選擇性，此機制有可能產(chǎn)生行之有效的吉非替尼耐藥NSCLC的分子靶向治療新策略，從而解決吉非替尼耐藥NSCLC治療的瓶頸問題。

總之，通過葫蘆素B的選擇性抑制作用及其信號分子導(dǎo)向，抑制吉非替尼耐藥NSCLC中異常激活的STAT3信號途徑，誘導(dǎo)吉非替尼耐藥NSCLC的凋亡，有可能產(chǎn)生有效而可行的吉非替尼耐藥NSCLC的分子靶向治療新策略，解決目前臨床中吉非替尼耐藥NSCLC治療中的難題，為該疾病的治療開創(chuàng)新的途徑，為中藥葫蘆素片老藥新用提供理論依據(jù)，通過葫蘆酚B的選擇性抑制作用及其信號分子指導(dǎo)，抑制吉非替尼耐藥NSCLC中異常激活的STAT3信號通路。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Ulahannan SV，Brahmer JR. Antiangiogenic Agents in Combination with Chemotherapy in Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer[J]. Cancer Invest，2011，29（4）：325-337.

[2] Nguyen KS，Kobayashi S，Costa DB. Acquired resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in non-small-cell lung cancers dependent on the epidermal growth factor receptor pathway[J]. Clin Lung Cancer，2009，10（4）：281-289.

[3] J？覿nne PA. Challenges of detecting EGFR T790M in gefitinib/erlotinib-resistant tumours[J]. Lung Cancer，2008， 60（2）：S3-89.

[4] Kobayashi S，Boggon TJ，Dayaram T，et al. EGFR Mutation and Resistance of Non-Small-Cell Lung Cancer to Gefitinib[J]. N Engl J Med，2005，352（8）：786-792.

[5] Pao W，Miller VA，Politi KA，et al.Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or edotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinasedomain[J].PLoS Med，2005，2（3）：e73.

[6] Kwak EL，Sordella R，Bell DW，et al. Irreversible inhibitors of the EGF receptor may circumvent acquired resistance to gefitinib[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2005， 102（21）：7665-7670.