先天性無虹膜合并先天性白內(nèi)障家系致病基因突變分析

陳 靖，朱思泉

0引言

先天性無虹膜(congenital aniridia)是一種嚴(yán)重的常染色體顯性遺傳疾病，多雙眼發(fā)病，以部分或全部虹膜缺失為其特征性臨床表現(xiàn)，可伴有其它眼部結(jié)構(gòu)異常，包括角膜混濁、青光眼、白內(nèi)障、晶狀體異位、斜視、眼球震顫等[1]。凡是肉眼可在前房周邊見到部分虹膜結(jié)構(gòu)者稱為部分性無虹膜，需用房角鏡檢查才能窺見少許虹膜殘端者稱為無虹膜。無虹膜患者多數(shù)伴有晶狀體皮質(zhì)、前后極或彌漫性混濁，偶爾可見晶狀體脫位或晶狀體缺損。此外，先天性無虹膜患者常因并存前房角小梁組織結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致先天性或發(fā)育性青光眼[2]。因致盲性及嚴(yán)重的并發(fā)癥，先天性無虹膜成為目前有待進(jìn)一步明確其致病基因的遺傳性眼部疾病之一。

先天性無虹膜在臨床上罕見，文獻(xiàn)報(bào)道其發(fā)病率約為1∶96000～1∶64000，其中瑞典為1∶76000，挪威為1∶70000[3]，我國(guó)發(fā)病率約為1∶100000。約2/3的病例為家族性，具有很高的外顯率，但表現(xiàn)度不一，有研究發(fā)現(xiàn)其外顯率達(dá)100%。此外，約1/3的病例為散發(fā)病例，部分散發(fā)病例常伴有全身異常，如骨骼畸形、顏面部發(fā)育不良、泌尿系統(tǒng)先天異常、發(fā)育遲緩及腎母細(xì)胞瘤(nephroblastoma，又稱Wilms瘤)，稱為WAGR綜合征(W指Wilms瘤；A指aniridia，即無虹膜；G指genitourinary anomalies，即泌尿生殖系統(tǒng)畸形；R指mental retardation，即智力發(fā)育遲緩)[4]。目前關(guān)于先天性無虹膜的基因研究已成為熱點(diǎn)，普遍認(rèn)為人類配對(duì)盒基因(paired box gene，PAX6)是其主要致病基因。PAX6基因是一種高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，是眼球發(fā)育的主要調(diào)控基因，并且對(duì)胰島細(xì)胞合成與分泌胰島素發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]，但并非所有先天性無虹膜病例皆為該基因突變所致。本研究收集了就診于北京同仁醫(yī)院眼科門診的某先天性無虹膜合并先天性白內(nèi)障家系，通過直接測(cè)序方法進(jìn)行PAX6基因篩查，以尋找可能的致病突變基因位點(diǎn)。

表1 引物序列

外顯子正向引物(5-3)反向引物(5-3)1AGGGAACCGTGGCTCGGCGGGTGAGGGAAGTGGCTGC2TTATCTCTCACTCTCCAGCCGGAGACCTGTCTGAATATTGC3TCAGAGAGCCCATCGACGTATCTGTTTGTGGGTTTTGAGCC4AGTTCAGGCCTACCTGATGCGTCGCGAGTCCCTGTGTC5CTCCCTCATCTTCCTCTTCCGGGGTCCATAATTAGCATCG6～7GGGCTACAAATGTAATTTTAAGAAAAGAGAGGGTGGGAGGAGGTA8GAGCTGAGATGGGTGACTGGAGAGTAGGGGACAGGCAAA9AGACTACACCAGGCCCCTTTTGAAGATGTGGCATTTACTTTGA10GTACCGAGAGACTGTGCAGTTTCTGAGGGCAAGAGAAATGACAGTAG11GGGCTCGACGTAGACACAGTGGAAACTGAGGGCAAGAGAA12CGGGCTCTGACTCTCACTCTGCCACTCCTCACTTCTCTGG13GCTGTGGCTGTGTGATGTGTAGGAGATTCTGTTTGGGTA14TCCATGTCTGTTTCTCAAAGGTCAACTGTTGTGTCCCCATAG

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象于2014-01/2015-01收集就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院眼科門診的先天性無虹膜合并先天性白內(nèi)障家系1個(gè)，該家系為具有明確遺傳病史的常染色體顯性遺傳家系，其中先天性無虹膜合并先天性白內(nèi)障患者3例。另選取100名健康志愿者作為對(duì)照。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，并經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受檢者均知情同意。

1.2方法

1.2.1檢查方法先天性無虹膜合并先天性白內(nèi)障家系成員均進(jìn)行視力、角膜、前房、虹膜、晶狀體、玻璃體、視網(wǎng)膜、眼壓、B型超聲、裂隙燈、眼底照相、前房角(表面麻醉下)等眼科檢查，并進(jìn)行全身檢查以排查是否伴有其它系統(tǒng)異常。

圖1先天性無虹膜家系圖圓圈表示女性，方框表示男性，實(shí)心表示患病，空心表示正常，羅馬數(shù)字表示代數(shù)，箭頭指示為先證者。

1.2.2基因檢測(cè)清晨于肘正中靜脈處采集受檢者外周靜脈血5mL。采用經(jīng)典酚-氯仿提取法提取DNA，經(jīng)紫外分光光度法檢測(cè)提取的DNA純度和濃度。根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center of Biotechnology Information，NCBI)提供的PAX6基因序列和參考文獻(xiàn)[4]設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增區(qū)覆蓋4～13外顯子及外顯子內(nèi)含子接頭處，引物序列見表1。以基因組DNA為模板，進(jìn)行特異性擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶并判斷是否擴(kuò)增成功。對(duì)擴(kuò)增特異性好的PCR產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶(SAP)和核酸外切酶Ⅰ處理，37℃酶切40min，80℃ 5min；對(duì)擴(kuò)增特異性差的PCR產(chǎn)物，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳(溴化乙錠染色)分離PCR產(chǎn)物，并用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit(天根生化科技有限公司)回收特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Millipore純化板純化，對(duì)純化的產(chǎn)物加入BigDye(美國(guó)ABI)做測(cè)序反應(yīng)，測(cè)序產(chǎn)物再次純化，純化產(chǎn)物溶解后上機(jī)，讀取基因序列信息。使用DNA star軟件、Chromas軟件對(duì)測(cè)序圖進(jìn)行拼接、讀取，尋找雜合位點(diǎn)并使用CLC DNAWbrkbench 5.0軟件分析突變位點(diǎn)是否導(dǎo)致氨基酸改變，并與100名健康志愿者的測(cè)序結(jié)果相對(duì)比，初步判斷是否為新的且保守的突變位點(diǎn)。

2結(jié)果

2.1系譜分析和臨床表現(xiàn)本研究選取的先天性無虹膜合并先天性白內(nèi)障家系共3代，連續(xù)3代成員每代均有發(fā)病，患者3例，其中女2例，男1例，患者的父母均有一方患病，子女發(fā)病的可能性為1/2，無性別差異，根據(jù)遺傳學(xué)圖譜分析，該家系呈常染色體顯性遺傳(圖1)。先證者是1名27歲女性，雙眼完全性無虹膜伴晶狀體皮質(zhì)及核混濁，彩色眼底照相結(jié)果因混濁晶狀體而模糊(圖2)。3例患者均表現(xiàn)為完全性無虹膜，并伴有晶狀體混濁，眼部檢查無其它畸形，角膜透明，眼壓正常，無眼球震顫等。該家系成員均未合并其它系統(tǒng)并發(fā)癥。

2.2PAX6基因測(cè)序結(jié)果PAX6基因突變分析結(jié)果顯示，在該家系先證者(Ⅱ1)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)雜合性c.991 C>T突變，位于PAX6基因外顯子11編碼區(qū)，其母親(Ⅰ2)的測(cè)序結(jié)果也發(fā)現(xiàn)這一雜合突變(圖3)。該基因突變是一個(gè)無義突變，使精氨酸(Arg)變?yōu)榻K止密碼(R331X)，使得翻譯提前終止，造成一個(gè)截短的蛋白，從而該蛋白失去功能。該家系其他正常成員與100名健康志愿者的測(cè)序結(jié)均中未發(fā)現(xiàn)此突變。

圖2先證者檢查結(jié)果A：右眼彌散光檢查結(jié)果；B：左眼彌散光檢查結(jié)果；C：右眼彩色眼底照相；D：左眼彩色眼底照相。

圖3PAX6基因測(cè)序圖A：先證者(Ⅱ1)測(cè)序圖；B：先證者母親(Ⅰ2)測(cè)序圖；C：健康志愿者測(cè)序圖。箭頭所示為突變位點(diǎn)，PAX6基因11外顯子c.991 C>T。

3討論

先天性無虹膜是由于在胚胎發(fā)育過程中神經(jīng)外胚層和中胚層出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致眼部結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，多為雙眼發(fā)病，分為部分性無虹膜和無虹膜。無虹膜者約50%～85%伴有白內(nèi)障，并有進(jìn)展趨勢(shì)，多伴有晶狀體板層、前后極或彌漫性混濁；由于懸韌帶的節(jié)段性缺失，還可見晶狀體脫位。另有約20%的患者可合并角膜混濁，其多繼發(fā)于角膜緣干細(xì)胞缺乏[1]。此外，約6%～75%的患者常合并青光眼，其中約91%的患者因前房角小梁組織結(jié)構(gòu)異常，常需多次抗青光眼手術(shù)才能相對(duì)控制眼壓進(jìn)展[6]。無虹膜者還因瞳孔極度散大，常有畏光，瞼裂變小，并由于眼部異常而引起視力減退，可并發(fā)眼球震顫、斜視等[7]。

胚胎發(fā)育過程中，PAX6基因在組織和器官的形成中發(fā)揮重要作用。PAX6基因位于第11號(hào)染色體短臂13位點(diǎn)(11p13)，是由14個(gè)外顯子組成的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，編碼由422個(gè)氨基酸組成的蛋白，包含61個(gè)氨基酸組成的同源結(jié)構(gòu)域(homeodomain，HD)和128個(gè)氨基酸組成的成對(duì)結(jié)構(gòu)域(paired domain，PD)，兩者間由一個(gè)79個(gè)氨基酸組成的連接體區(qū)域(link domain，LNK)分隔，其下游還有一個(gè)由79個(gè)氨基酸組成的富含脯氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的轉(zhuǎn)錄反式激活域(proline serine threoninrichdomain，PST)，可激活PAX6蛋白調(diào)控的下游基因的表達(dá)[8]。目前，PAX6基因在眼球發(fā)育中發(fā)揮的作用還未完全闡明，PAX6蛋白被認(rèn)為能夠激活參與眼球、中樞神經(jīng)系統(tǒng)及胰腺發(fā)育的相關(guān)基因。此外，PAX6蛋白亦表達(dá)于眼球各種組織中，包括視盤、視泡、晶狀體、角膜上皮、虹膜、睫狀體、神經(jīng)視網(wǎng)膜各層以及視網(wǎng)膜色素上皮。對(duì)于發(fā)育中的眼球，PAX6蛋白首先在視窩中表達(dá)，其次是視泡，隨后為分化的視網(wǎng)膜[9]。目前已有超過400個(gè)PAX6基因的突變位點(diǎn)被報(bào)道[10]。PAX6基因突變多發(fā)生在外顯子5～14，突變方式多樣，分為6種突變類型，即無義突變、剪接突變、框移突變、框內(nèi)缺失或插入突變、錯(cuò)義突變和連綴突變。無義介導(dǎo)降解(nonsense-mediated decay，NMD)為先天性無虹膜最常見的突變類型，通常使包含PTCs(pre-mature termination codons，PTCs)的mRNA在翻譯成截短蛋白前降解，阻止了截短蛋白合成，PAX6基因發(fā)生突變而成為無效等位基因，致使基因單倍劑量不足，出現(xiàn)典型的無虹膜癥狀[11]。

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，先天性無虹膜與先天性白內(nèi)障可同時(shí)存在，這部分患者的白內(nèi)障發(fā)病年齡較早、手術(shù)難度大、術(shù)后視力改善有限[12]，有研究認(rèn)為其發(fā)病原因可能與PAX6基因突變有關(guān)[13-14]。此外，先天性白內(nèi)障還可并發(fā)先天性虹膜缺損，有文獻(xiàn)報(bào)道該過程與16號(hào)染色體MAF基因突變有關(guān)[15]，也有學(xué)者認(rèn)為其致病基因可能位于2q33染色體上[16]。另有研究觀察15例先天性白內(nèi)障合并虹膜發(fā)育異?；颊叩呐R床表型發(fā)現(xiàn)，其中7例核性白內(nèi)障患者并發(fā)完全性虹膜缺損，2例全白內(nèi)障患者并發(fā)部分完全性虹膜缺損，5例全白內(nèi)障患者并發(fā)無虹膜，1例縫性白內(nèi)障患者并發(fā)無虹膜，表明先天性白內(nèi)障表型與虹膜發(fā)育不全有一定的規(guī)律性，但還需進(jìn)一步觀察研究[17]。

本研究在先證者及該家系其他患病成員的PAX6基因11外顯子中發(fā)現(xiàn)一個(gè)無義突變c.991 C>T(p.331R>X)，家系中其他正常成員及家系外正常對(duì)照無該突變，提示這一突變是導(dǎo)致該家系先天性無虹膜合并先天性白內(nèi)障的主要原因。該突變位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，不僅擴(kuò)展了PAX6基因的突變譜，還為先天性無虹膜合并先天性白內(nèi)障家系的遺傳咨詢與產(chǎn)前診斷提供重要的依據(jù)，對(duì)預(yù)防患者后代中再次出現(xiàn)該病的發(fā)生具有一定的指導(dǎo)意義。