Rho激酶抑制劑在青光眼治療中的應(yīng)用進(jìn)展

陳文詩，宋 娜，張雨晴，楊雪嬌，朱 瑋，楊 先

0引言

青光眼作為第一大不可逆性致盲性眼病，是以特征性視神經(jīng)萎縮和視野缺損為共同特征的疾病[1]。2010年全球青光眼患者約6000萬人，預(yù)計(jì)2020年將達(dá)到8000萬人，2040年全球?qū)⒂?億多青光眼患者，而中國2010年青光眼患者約有1600多萬人，預(yù)計(jì)2020年將超過2000萬人[2-3]。在各種類型的青光眼中最常見的是開角型青光眼[3]。高眼壓是青光眼最主要的致病機(jī)制，導(dǎo)致眼壓升高的主要原因是房水傳統(tǒng)流出途徑中小梁網(wǎng)(trabecular meshwork,TM)的病理學(xué)改變所致房水外流阻力增加[4]。研究表明TM細(xì)胞是房水傳統(tǒng)流出途徑的主要細(xì)胞，有調(diào)節(jié)眼壓平衡的重要作用，通過這一途徑房水正常流出幾乎沒有任何阻力，但是如果TM細(xì)胞發(fā)生功能障礙，這一無阻力的房水流出途徑便產(chǎn)生了額外的“阻力”，導(dǎo)致房水外流阻力增加，這就是大部分青光眼眼壓升高的原因[5]。

目前臨床中延緩青光眼進(jìn)展的最主要方式就是控制眼壓，研究表明眼壓降低20%～40%可使視野損失的進(jìn)展延緩一半[6]。青光眼治療首選降眼壓藥物，其次為激光和手術(shù)治療[1]。目前最常用的降眼壓藥物包括擬交感神經(jīng)藥、β-腎上腺能阻滯劑、腎上腺能受體激動劑、前列腺素衍生物、碳酸酐酶抑制劑、高滲劑等，分別通過增加房水流出、抑制房水生成、減少眼內(nèi)容積等途徑降低眼壓來治療青光眼[7]。但是這些降眼壓藥物都沒有作用于青光眼最根本的致病部位——TM細(xì)胞。此外，部分患者無法用藥物控制眼壓則需激光或手術(shù)治療，然而通過這些有創(chuàng)的方式仍有部分青光眼患者病情進(jìn)行性加重，最終導(dǎo)致失明。鑒于青光眼致盲的不可逆性、患病人群的龐大及目前治療方式的局限性，尋找新的青光眼治療方式迫在眉睫。

近期研究發(fā)現(xiàn)Rho激酶抑制劑(Rho-associated protein kinase inhibitor, ROCKi)主要通過改變TM細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞運(yùn)動、胞質(zhì)分裂和平滑肌收縮等影響細(xì)胞骨架，從而增加房水流出，降低眼壓。ROCKi作為直接作用于TM細(xì)胞的降低眼壓的新型藥物，在青光眼原發(fā)病變部位進(jìn)行治療，已于2014年在日本被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床使用[8-10]。由于ROCKi具有增加血管灌注、促進(jìn)視神經(jīng)再生等作用，可能對視神經(jīng)也有保護(hù)作用，此外，還具有減少濾過泡瘢痕化等作用[11]。綜上，ROCKi作為新型降眼壓藥物有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用前景。本文將針對Rho/Rho激酶信號通路、ROCKi的作用機(jī)制及其臨床應(yīng)用展開綜述。

1 Rho/Rho激酶信號通路及其作用

1.1 Rho/Rho激酶信號通路Rho蛋白是由Rho基因編碼的信號肽，由200～300個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為20～30kDa。在細(xì)胞信號傳導(dǎo)中，Rho蛋白起著開關(guān)作用，當(dāng)Rho蛋白與GDP結(jié)合，使Rho蛋白激活。Rho激酶(Rho-associated protein kinase inhibitor, ROCK)為Ras超家族之一的Rho亞組，是一組分子量約為160kDa的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，而激活的Rho蛋白與ROCK結(jié)合使之活化，活化的ROCK可使下游的細(xì)胞內(nèi)底物磷酸化。最具代表性的底物包括肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)、肌球蛋白磷酸酶底物1(myosin phosphatase substrate 1, MYPT1)、LIM激酶、CP1-17、鈣調(diào)蛋白(calmodulin, CaM)和ERM蛋白質(zhì)。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)可以直接使MLC磷酸化，調(diào)節(jié)平滑肌的收縮，而激活的ROCK是MLCK活化的關(guān)鍵調(diào)控途徑，并且近期研究表明RCOK可以獨(dú)立調(diào)節(jié)Ca2+的血管平滑肌收縮和細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的相互作用，來調(diào)節(jié)房水的外排[12]。同樣，ROCK的激活可以使MYPT1磷酸化，抑制激動蛋白的收縮[13]。正是由于ROCK通過與這些底物相互作用，調(diào)節(jié)肌球/動蛋白收縮、細(xì)胞粘附、細(xì)胞僵硬度、細(xì)胞形態(tài)和ECM合成，從而調(diào)控房水的流出，維持眼壓平衡[14]。

1.2 Rho/Rho激酶信號通路在青光眼發(fā)病機(jī)制中的作用Rho激酶的兩種同工型ROCK1(ROKb/P160)和ROCK2(ROKa)，具有近65%的同源性，并且由位于人體上的兩種不同基因編碼，分別位于18號和2號染色體。眼部組織中除晶狀體外都同時(shí)有ROCK1和ROCK2的表達(dá)，以往研究表明ROCK1和ROCK2基因敲除的小鼠出現(xiàn)眼壓降低的現(xiàn)象，進(jìn)一步證實(shí)ROCK的缺失對眼壓有降低作用[15]。在青光眼患者的房水中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-beta，TGF-β)、溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)等細(xì)胞因子的高表達(dá)，而TGF-β能夠顯著增加交聯(lián)肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)(cross-linked actin networks, CLANs)的形成，誘導(dǎo)ECM蛋白質(zhì)的合成，并且可以促進(jìn)CTGF的產(chǎn)出，使細(xì)胞粘附性增加，增加細(xì)胞硬度，增加房水流出阻力[16]。LPA可以誘導(dǎo)多種類型的細(xì)胞反應(yīng)，包括ROCK調(diào)節(jié)的細(xì)胞粘附、收縮、細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、細(xì)胞因子和趨化因子分泌、血小板聚集、平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化和神經(jīng)突回縮，可以影響TM細(xì)胞的收縮和粘附特性，并被認(rèn)為參與青光眼的發(fā)病機(jī)制[17]。此外，通過比較正常眼與青光眼TM細(xì)胞骨架發(fā)現(xiàn)，青光眼的F-actin蛋白位于更中心的位置，并且呈無序的形態(tài)，細(xì)胞骨架的改變是青光眼的一大重要致病機(jī)制[18]。青光眼患者通過促進(jìn)Rho/Rho激酶信號通路傳導(dǎo)途徑，使下游MYPT1、MLC、LIMK等細(xì)胞因子增多，肌球/動蛋白平衡改變，增加ECM蛋白質(zhì)的合成，改變了細(xì)胞骨架，使細(xì)胞粘附性增加，最終導(dǎo)致房水流出減少，眼壓升高[11]?；赗OCK在肌動蛋白管理的重要作用，所以ROCKi作為促進(jìn)TM細(xì)胞房水流出的降眼壓藥物，也是直接作用于青光眼病變原發(fā)部位的藥物而備受矚目[19]。

2 ROCKi的降眼壓作用

2.1不同ROCKi的降眼壓作用機(jī)制目前研究發(fā)現(xiàn)不同種類的ROCKi，包括Y-27632、Y-39983、HA-1077、H-1152、K-115等均有改變TM細(xì)胞收縮的作用，一定程度增加房水流出，降低眼壓。但是其作用濃度、降眼壓的幅度、作用機(jī)制有一定的差異，如Y-39983局部給藥降眼壓作用比Y-27632明顯，HA-1077對ROCK的特異性較Y-27632弱[20-22]。其中Y-27632為最近發(fā)現(xiàn)的一種Rho激酶抑制，也是最常用于研究改善房水流出功能機(jī)制的ROCKi，對ROCK1和ROCK2的選擇性抑制幾乎沒有差異[14, 23]。其在不同物種有一定的降低眼壓作用，下文將以Y-27632作為ROCKi代表詳細(xì)講述其降眼壓的機(jī)制。

在體外實(shí)驗(yàn)中，通過Y-27632處理的人TM細(xì)胞在顯微鏡下觀察出現(xiàn)了細(xì)胞收縮、變圓的形態(tài)學(xué)變化，并且在免疫熒光顯微鏡下觀察到通過Y-27632處理的細(xì)胞大部分肌動蛋白束消失、粘著斑的減少等細(xì)胞骨架的改變，并且明顯抑制了TGF-β誘導(dǎo)CLANs的形成， 定量PCR發(fā)現(xiàn)Y-27632處理過的細(xì)胞明顯比地塞米松處理過的細(xì)胞纖維連接蛋白、ECM蛋白的表達(dá)低，Western免疫印記可以看出經(jīng)過Y-27632使細(xì)胞纖維連接蛋白，膠原蛋白1A和波形蛋白的表達(dá)顯著降低，并且Y-27632可以誘導(dǎo)肌球蛋白輕鏈的去磷酸化，而MLC磷酸化狀態(tài)是Rho//Rho激酶信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞和松弛的重要因素[16, 24-25]。凝血酶增加細(xì)胞硬度高達(dá)200%，而同時(shí)加入Y-27632可使細(xì)胞硬度減低到40%～80%；凝血酶可使細(xì)胞電阻增加到160%，而Y-27632將細(xì)胞電阻降低至60%左右，并導(dǎo)致細(xì)胞與細(xì)胞的分離[26]。這些都表明Y-27632通過對細(xì)胞骨架和ECM的影響，從而改善房水流出功能，起到降眼壓作用。另外，以往研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)對TM細(xì)胞有放松作用，增加房水流出量，并且青光病患者眼中NO和NOS的表達(dá)水平降低，ROCKi對eNOS mRNA和NO產(chǎn)生的促進(jìn)作用，這也可能與其降眼壓作用有關(guān)[27]。除了目前較常使用的ROCKi，最近又新發(fā)現(xiàn)了一種新型ROCKi—SB772077B，在和Y-27632相同濃度處理細(xì)胞顯示出更明顯的細(xì)胞收縮，肌蛋白束和黏著斑的減少。這種新型ROCKi對ROCK1的選擇性比ROCK2更高[28]。

2.2 Y-27632在不同物種中的降眼壓作用1997年首次通過局部給藥、前房注射、玻璃體注射Y-27632分別測量兔眼的眼壓和房水流暢系數(shù)、瞳孔直徑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Y-27632有明顯增加房水流出、增大瞳孔直徑和降眼壓的圖1Rho激酶抑制劑在青光眼治療中的作用模式圖。

作用[29]。之后Y-27632作為最常用的ROCKi在不同物種實(shí)驗(yàn)中被廣泛用于ROCKi的降眼壓機(jī)制研究。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，Y-27632在小鼠、兔、豬、猴、人身上都有顯著增加房水流出，降低眼壓的作用[15]。在豬眼、猴眼和人眼灌注模型中，灌注不同壓力的Y-27632都呈現(xiàn)出近管小梁組織(juxtacanalicular TM，JCT)增厚，與房水流暢系數(shù)顯著增大的結(jié)果成正相關(guān)[23]。但是由于灌注系統(tǒng)的不同，達(dá)到顯著差異的時(shí)間和灌注量不同種類也不相同，無法進(jìn)行種群的比較[24, 30-31]。但是可以明顯看出Y-27632有改善房水外流的作用(圖1)。

3 ROCKi在青光眼領(lǐng)域中的臨床應(yīng)用

3.1 ROCKi的降眼壓應(yīng)用基于以上體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的研究，一些醫(yī)藥公司開始探索ROCKi在人體中降眼壓的影響，相繼研發(fā)新藥物，在評估人體臨床安全性和有效性后，目前研發(fā)出的藥物包括Ripasudil(K-115)、Fasudil(HA-1077)、SNJ-1656、AMA0076、AR-12286和Netarsudil(AR-13324)等，其中Fasudil為雖然被批準(zhǔn)運(yùn)用于臨床，但是還未用于青光眼的治療[32]， Ripasudil(Kowa)和Netarsudil(Aerie)，分別在日本和美國成功進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段。在Ⅲ期臨床試驗(yàn)中，每日兩次局部給予0.4% ripasudil平均減少青光眼患者晝夜眼壓2.9mmHg。Ripasudil最近在日本獲得批準(zhǔn)用于治療高眼壓和青光眼，并且這種藥物與β受體阻滯劑噻嗎洛爾聯(lián)用時(shí)可以增強(qiáng)療效，這也預(yù)示作為與其他降眼壓藥物有不同降眼壓機(jī)制的ROCKi可與其他類型降眼壓藥物聯(lián)用，增大降眼壓的效果。在Ripasudil Ⅲ期臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，輕度結(jié)膜充血為最常見的不良反應(yīng)，發(fā)生率高達(dá)75%。此外，結(jié)膜炎、點(diǎn)狀角膜炎等也有發(fā)生[8, 14]。Netarsudil為ROCK/去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(norepinephrine transporter, NET)抑制劑化合物，除了作為RCCK抑制劑的作用外，還有抑制去甲腎上腺素的作用，具有持續(xù)降眼壓的作用，并且局部耐受性好，僅有輕度的結(jié)膜充血反應(yīng)[33]。針對現(xiàn)有ROCKi藥物的不良反應(yīng)，目前改進(jìn)的手段包括使用ROCK2特異性抑制藥物KD025和短效的溫和型ROCKi。不過目前看來，經(jīng)過3a的臨床應(yīng)用，目前還沒有發(fā)生較嚴(yán)重的不良事件[34]。因此，ROCKi這一直接作用于TM細(xì)胞的可以顯著降眼壓的新型藥物是值得期待的。

3.2 ROCKi的其他眼部效應(yīng)有研究表明，ROCKi除了作用于TM細(xì)胞而降低眼壓外，對眼部其他部位的作用也可能有額外的效果，如延緩青光眼的進(jìn)展、降低青光眼術(shù)后濾過道瘢痕化等。青光眼性視神經(jīng)損傷的機(jī)制之一是血管缺血，導(dǎo)致視神經(jīng)供血不足。最近，在小鼠動物模型中發(fā)現(xiàn)Ripasudil可以減輕視網(wǎng)膜水腫、減少缺血灌注區(qū)、改善視網(wǎng)膜靜脈的灌注[10]。因此，ROCKi對于減緩青光眼的進(jìn)展，不僅是由于降低眼壓，還可能通過改善視神經(jīng)缺血而發(fā)揮作用。此外，有研究報(bào)道稱ROCKi對小鼠的視神經(jīng)具有保護(hù)作用，可促進(jìn)視神經(jīng)軸突的再生，但在人體上是否也有同樣的效果仍需進(jìn)一步試驗(yàn)，如果在人身上有同樣作用，那么ROCKi不僅在TM細(xì)胞上有著降眼壓的作用，并且對于視神經(jīng)也可能具有保護(hù)作用。另外，目前青光眼濾過手術(shù)失敗的主要原因就是濾過泡和ECM沉積物瘢痕化，成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞是傷口愈合和瘢痕形成的關(guān)鍵步驟，與ECM蛋白、生長因子和整合素的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)，最近研究表明ROCKi可通過抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞來減少瘢痕，主要是通過抑制TGF-β信號傳導(dǎo)和LPA誘導(dǎo)的纖維化反應(yīng)減少膠原蛋白基質(zhì)收縮和ECM沉積[11](圖1)。

4展望

綜合前期的基礎(chǔ)研究、臨床試驗(yàn)及近3a的臨床應(yīng)用，ROCKi作為直接作用于TM細(xì)胞的新型降眼壓藥物的效果是值得肯定的。如果今后進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ROCKi在人體上也有增加血液灌注，促進(jìn)視神經(jīng)再生的作用，那么ROCKi對于青光眼患者治療中的應(yīng)用價(jià)值可能會進(jìn)一步提升。但是，目前對于ROCKi的認(rèn)識還不夠充分，其降眼壓的機(jī)制尚未有完全的認(rèn)識，需要進(jìn)一步的研究。