高效液相色譜法測(cè)定乙酰烏頭堿片含量及含量均勻度

解瑞輝，郭社民，申利平

（1.河南省濮陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，河南 濮陽 457000； 2.河南省濮陽市食品監(jiān)督所，河南 濮陽 457000）

乙酰烏頭堿片曾用名3-乙酰烏頭堿片、新烏寧通片，適用于各類止痛[1-3]，主要成分為 20- 乙基 -l，6，1 6-三甲基氧基 -4-（甲氧基甲基）烏頭烷 -3，8，13，14，15-五醇-3，8-二醋酸醋-14-苯甲酸酯，系由毛蓖科烏頭屬植物伏毛鐵棒錘中分離提取有效成分加工制成的片劑。乙酰烏頭堿片現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用紫外可見分光光度法（UV）測(cè)定其含量[4]。國內(nèi)有2家企業(yè)生產(chǎn)乙酰烏頭堿片，規(guī)格均為0.3 mg，重量差異不能真正反映藥品的均勻性。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定乙酰烏頭堿片的含量，同時(shí)增加含量均勻度的測(cè)定?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

Waters2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），包括Empower3化學(xué)工作站和2489UV／vis檢測(cè)器；Secomam UVIKON xL型雙光束掃描紫外／可見分光光度計(jì)（法國賽克曼公司）；Mettler Toledo XS205EU型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。乙酰烏頭堿（阿拉丁工業(yè)公司，美國 CAS NO.77181-26-1，LOT.E1508001，含量為98%）；乙酰烏頭堿片（市售，北京某廠家，批號(hào)為20180403；陜西某廠家，批號(hào)分別為170801，171101；規(guī)格均為0.3 mg）；甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇、無水三氯甲烷均為分析純，碳酸氫銨（優(yōu)級(jí)純），水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersBridgeC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%碳酸氫銨溶液 -乙腈 （60 ∶40，V∶V）；流速：1.0 mL ／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：232 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。外標(biāo)法峰面積定量。

2.2 溶液制備

稱取乙酰烏頭堿15.32 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶，加無水氯仿5 mL，超聲溶解，用70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備液；精密量取貯備液5 mL，置50 mL容量瓶，加70%乙醇至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。按處方制備工藝制得不含乙酰烏頭堿的陰性對(duì)照品溶液。取本品20片，精密稱定，研細(xì)，稱取適量（約相當(dāng)于乙酰烏頭堿1.5 mg），置50 mL容量瓶，加無水氯仿5 mL超聲溶解，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn)：分別精密量取陰性對(duì)照品溶液、對(duì)照溶液、供試品溶液各20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果其他成分對(duì)乙酰烏頭堿的分析無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液2，3，5，10，15，20 mL，分別置 100 mL 容量瓶中，加 70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取溶液各20 μL，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝4 030.2X-1 520.4，r＝0.999 8（n＝6）。結(jié)果乙酰烏頭堿進(jìn)樣質(zhì)量濃度在 6.0 ～60.2 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下同一對(duì)照品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果乙酰烏頭堿峰面積的RSD為0.28%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下同一批（批號(hào)為170801）供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，10，12 h 時(shí)分別精密量取20 μL注入色譜儀測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果乙酰烏頭堿峰面積的RSD為0.79%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為170801）供試品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.93%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取已知含量的供試品細(xì)粉（批號(hào)為 170801，含量為每片 0.2973mg），精密稱定，共 9 份，分別置50 mL容量瓶中，分別精密加入對(duì)照品貯備液4，5，6 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL注入液相色譜儀，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 乙酰烏頭堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.4 樣品含量及含量均勻度測(cè)定

含量測(cè)定：取3批供試品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批平行3份，照擬訂色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 供試品含量及含量均勻度測(cè)定結(jié)果

含量均勻度測(cè)定：分別取3批供試品各10片，研細(xì)，分別置10 mL容量瓶中，加無水氯仿1 mL超聲溶解，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻。照擬訂色譜條件測(cè)定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算每片的標(biāo)示量，按2015年版《中國藥典（四部）》通則 0941[5]含量均勻度檢查法，計(jì)算A＋2.2S。結(jié)果見表 2。

3 討論

曾試用不同比例甲醇-水、甲醇-碳酸氫銨溶液、甲醇-磷酸二氫鉀溶液等作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，但均不理想。參考文獻(xiàn)[6]，以碳酸氫銨溶液-乙腈為流動(dòng)相，峰形對(duì)稱性符合要求，乙酰烏頭堿峰的理論板數(shù)高，與三氯甲烷的峰分離度較好。

國內(nèi)2家藥品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)乙酰烏頭堿片，規(guī)格均為 0.3 mg。按《中國藥典（四部）》要求片劑、硬膠囊劑、顆粒劑或散劑等每一單劑標(biāo)示量均小于25 mg，建議檢查含量均勻度[5]，增強(qiáng)制劑學(xué)對(duì)藥物的質(zhì)量控制。

乙酰烏頭堿易溶于三氯甲烷，幾乎不溶于乙醇，不溶于水。故用無水三氯甲烷溶解，試驗(yàn)過程中溶劑中的三氯甲烷對(duì)乙酰烏頭堿的分離有影響；曾嘗試揮干三氯甲烷但重復(fù)性較差，試驗(yàn)過程應(yīng)選擇適宜的色譜柱。